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维持基因组的完整性是生命体中最重要的机能之一,它是维持物种能够稳定的生存和繁衍的前提。但是,DNA常常会受到各种物理的(紫外线,离子辐射等)和化学的(环境污染物,内源活性代谢物如活性氧等)攻击,造成损伤。而损伤的基因组会给生命体带来突变,严重的甚至可以致死。于是生命体发展了一系列复杂的修复途径去对抗损伤,去维持基因组和生命体的完整性。在这些修复途径中,各种核酸外切酶的作用是其中不可或缺的一环,此外在DNA复制过程中,由于聚合酶的保真度问题,总会不时的掺入错误的核苷酸,这时也需要核酸外切酶的作用去纠正错误。DnaQ家族就是一类在上述各种修复过程和保真校正过程中起重要作用的核酸外切酶,它包括了ExoX在内的众多成员,从1964年开始最早发现ExoI开始算起,对DnaQ家族的研究已经经历了近半个世纪。DnaQ家族蛋白的作用机理和生物学功能也已经有了众多的研究,这是一类具有3’-5’方向性的核酸外切酶,它可以催化断裂最后两个核苷酸之间的磷酸二酯键。尽管DnaQ家族的研究历史相当悠久,但还是有一些如双链DNA的酶切机制等的重要问题没有完全解释清楚。因此,我们解析了ExoX和多种DNA的复合物结构,以希望能够为这些问题的解释提供方向。
我们解析的ExoX结构来源于大肠杆菌,在它与3’端含有2个核苷酸粘性末端的17dsDNA复合物晶体结构中,我们发现在蛋白活性中心有两个金属离子结合位点,在这两个位点处结合了两个Ni离子,通过对这两个Ni离子配位情况和周围水分子的共价键分析,我们提出了ExoX的酶切分子机制,这个酶切机制和前人发现的Epsilon的酶切机制是高度类似的,表明DnaQ家族反应机制的高度保守性。我们在蛋白表面还发现了两个DNA磷酸骨架结合位点,一个位于活性中心附近用来结合DNA3’端的酶切底物,另一个位于蛋白外表面,供DNA5’端的磷酸骨架结合使用。在这个外表面结合位点中,既有DnaQ家族保守的Lys101,Arg104,Arg105,也有ExoX所独有的Arg86和Arg87。此外通过对我们的结构分析,发现一个和前人不同的DNA双链结合机制,在我们的机制中,无需粘性末端单链的翻转,证明了这种单链翻转机制并不是DnaQ家族进行酶切反应所必须的。
为了解释ExoX的双链酶切机制,我们还另外解析了ExoX和部分配对DNA的复合物晶体结构,这种部分配对DNA中间可以相互配对,形成的双链DNA两端的5’端要长于3’端。通过对这个结构的分析,我们发现Leu12在DNA碱基对的打开过程中可能起了关键作用,此外蛋白外表面的第二个DNA磷酸骨架结合位点也是ExoX的双链酶切过程中不可缺少的。