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第一部分载药靶向胶原相变纳米粒CNA35/PFP/DIZE@NPs的制备及性能检测目的:制备一种携带胶原特异性结合蛋白(CNA35)的载血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme2,ACE2)激动剂三氮脒(diminazene aceturate,DIZE)的液态氟碳脂质纳米粒(CNA35/PFP/DIZE@NPs),并研究其理化性质。方法:采用逆向旋转蒸发法联合声振法制备相变型载药的液态氟碳脂质纳米粒(DIZE/PFP/@NPs),采用碳二亚胺法在表面连接CNA35得到载药靶向相变纳米粒(CNA35/PFP/DIZE@NPs)。对其外观、粒径、电位、连接率、载药量及包封率进行测量,并观察纳米粒在体外的稳定性以及药物释放能力。通过不同的温度及超声强度处理纳米粒,观测其液-气相变情况。结果:制备的载药靶向相变纳米粒CNA35/PFP/DIZE@NPs在光镜及荧光显微镜下呈点状,分散均匀;透射电镜观察纳米粒呈球形,大小均匀。Malvern激光粒径仪器测量纳米粒,粒径为(304.68±4.21)nm,电位(-14±0.23)mV,与非靶向或非载药纳米粒对比,其粒径大小差异无统计学意义。流式细胞仪检测CNA35连接到纳米上的连接率为(75±0.34)%。体外稳定性检测显示纳米粒在4℃的温度下24h内形态和粒径无明显变化。高效液相色谱法测量纳米粒的包封率为(25.33±9.47)%,载药量为(3.80±0.65)%,体外药物释放检测显示纳米粒在12h内药物释放较快,24h内药物释放约24%,36h药物释放大于50%,而后进入一个缓慢释放的平台期。采用不同强度的超声辐照纳米粒,随着超声强度的增加,纳米粒释放药物的量也明显增加。采用不同温度加热纳米粒,镜下观察40℃时纳米粒未见明显变化;45℃时镜下可见部分纳米粒体积变大,呈微泡样改变;50℃时镜下见大量的微泡;55℃时镜下见大部分纳米粒迅速相变成微泡,部分并瞬间破碎。采用不同参数的超声辐照纳米粒观察到随着超声强度的增强和辐照时间的延长,声致相变的纳米粒在超声仪器的检测下呈现不同强度的超声增强显像。体外声致相变发现超声参数为强度3W/cm~2辐照时间3min的条件,不仅能致大量纳米粒相变,还能达到较为理想的超声增强显像。结论:成功制备了携带CNA35抗体和载DIZE药物的液态氟碳脂质纳米粒(CNA35/PFP/DIZE@NPs),其形态规整,大小均匀,理化性质稳定,具有良好的液-气相变及药物释放能力。第二部分载药靶向胶原相变纳米粒CNA35/PFP/DIZE@NPs对兔心肌纤维化显像研究目的:检测CNA35/PFP/DIZE@NPs纳米粒对兔心肌纤维化的体内外的靶向性以及其超声分子显像效果。方法:该部分实验研究分为三小节。第一节建立兔心肌纤维化模型,采用开胸结扎兔左冠状动脉的方法建立心肌纤维化模型,模型建立4w后行病理组织HE、PSR和Masson染色以及FITC-CNA35染色检查心肌纤维化程度。第二节制备兔心肌纤维化冰冻切片,用制备的CNA35/PFP/DIZE@NPs纳米粒处理心肌纤维化切片,激光共聚焦显微镜观测其体外靶向性。体内靶向性检测通过静脉注射CNA35/PFP/DIZE@NPs纳米粒10min后,处死动物行冰冻切片,激光共聚焦显微镜下观察其体内靶向效果。第三节通过兔耳缘静脉注射CNA35/PFP/DIZE@NPs纳米粒后,用强度为3W/cm~2的LIFU辐照3min后用诊断超声观察其体内心肌纤维化的超声显像。结果:采用开胸结扎左冠状动脉建立起来心肌纤维化模型,通过PSR、Masson和CNA35染色心肌纤维显示,纤维化范围分别为(31.29±4.95)%,(32.31±5.49)%和(27.56±5.35)%,其之间差异无统计学意义(P>0.05)。体内外靶向检测显示,FITC-CNA35偶联在NPs上,在激光共聚焦显微镜下呈绿色,Di I标记的脂质膜呈红色,DAPI标记的细胞核呈蓝色荧光。从冰冻切片上可以明显观察到蓝染的细胞核间隙内可见大量的红色与绿色荧光,两种荧光重叠性较好。结果表明心肌纤维后大量胶原沉积于细胞间质当中,而胶原特异性结合蛋白CNA35能够很好的靶向心肌纤维化后细胞间质里沉积的胶原。结论:制备的CNA35/PFP/DIZE@NPs纳米粒具有靶向心肌梗死后心肌纤维化的胶原。第三部分载药靶向胶原相变纳米粒CNA35/PFP/DIZE@NPs治疗兔心肌纤维化的研究目的:观察CNA35/PFP/DIZE@NPs纳米粒治疗心肌纤维化的研究。方法:建立兔心肌梗死模型,1周后随机分4组,每组5只动物,分别为:心肌梗死(MI)组;单纯靶向相变纳米粒CNA35/PFP@NPs(C-NPs)组;单纯药物(DIZE)组;载药靶向相变纳米粒CNA35/PFP/DIZE@NPs(C-D-NPs)组。每组处理前均行常规超声心动图评价各组心脏功能。DIZE组和C-D-NPs组经兔耳缘静脉注射0.5mg/kg的DIZE治疗;MI组和C-NPs组注射等量的生理盐水。注射后均用功率为3W/cm2的低功率聚焦超声治疗仪(LIFU)辐照兔心前区,辐照时间为3min,并用诊断超声观察心肌回声强度,每3天处理1次,共处理4次。4周后通过超声心动图评价各组心脏功能。处死动物取心肌梗死边缘区组织行心肌胶原染色;RT-PCR检查心肌组织内血管紧张素转化酶ACE2和ACE基因水平表达量;用ELISA法测定心肌组织中I型胶原(collagenⅠ)、血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)和Ang(1-7)的含量;用Western blot检测心肌组织血管紧张素Ⅱ受体1(angiotensin Ⅱ type 1 receptor,AT1R)和Mas R受体蛋白表达情况。结果:超声心动图检查结果显示:治疗前各组左心室收缩功能EF值均降低约为46%,组间差异无统计学意义。但是经不同治疗处理后,C-D-NPs组和DIZE组两组较另外两组心功能明显恢复,差异具有统计学意义;C-D-NPs组射血分数EF恢复也优于DIZE组(P<0.05)。PSR和Masson胶原染色结果显示:MI组与C-NPs组胶原染色明显较DIZE组和C-D-NPs组广泛。MI组与C-NPs组,DIZE组与C-D-NPs组间的胶原染色差异无统计学意义。RT-PCR检查结果显示:C-D-NPs组的ACE2表达明显高于MI组,而ACE低于MI组,差异具有统计学意义(P<0.05);与DIZE组比较,ACE2的表达差异具有统计学意义(P<0.05),而ACE的表达两组差异无统计学意义(P>0.05)。两种基因扩增倍数相关性比较显示C-D-NPs组ACE2/ACE明显高于其它三组,差异具有统计学意义(P<0.05)。ELISA检查显示C-D-NPs组的Ang(1-7)含量明显高于MI组,而Ang Ⅱ和Collagen I低于MI组,差异具有统计学意义(P<0.05);与DIZE组比较,Ang(1-7)和CollagenⅠ的含量差异具有统计学意义(P<0.05),Ang Ⅱ的含量两组差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot半定量分析显示,C-D-NPs组和DIZE组中AT1R表达量明显低于MI组和C-NPs组,而Mas R的表达量则明显高于另外两组,差异具有统计学意义(P<0.05;两组间Mas R表达量差异具有统计学意义(P<0.05),而AT1R表达差异则无统计学意义(P>0.05)。结论:成功研制了一种携CNA35分子探针靶向心肌胶原的液-气相变型载血管紧张素转换酶2激动剂三氮脒的氟碳纳米粒,联合超声辐照能够治疗心肌纤维化,为心肌纤维化的精准诊疗提供了一种新的方法。