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防御素(defensins)是生物体在抵御病原微生物的防御过程中产生的一类重要的抗菌肽类物质。它具有十分广泛的抗菌谱,可以抵抗细菌、真菌、被膜病毒等多种微生物。由于其独特的抗菌机制,不会诱发细菌耐药性的产生,已成为具有巨大发展潜力的新型抗菌药物。猪β防御素-1(porcine β-defensin1, pBD-1)是广泛分布于猪消化道、呼吸道、肝和肾等多种组织细胞内的一类活性多肽,在猪防御系统中起重要作用。它同样可被用作食品保鲜剂和饲料添加剂,随着对其研究的深入,可以相信猪防御素将在动物养殖、疾病预防和提高畜产品品质等方面发挥更大作用。本研究的目的就是在克隆猪舌上皮防御素的基础上,利用大肠杆菌表达系统实现pBD-1的高效表达,通过蛋白复性方法,以期获得高产量有活性的防御素产品,为猪防御素的工程化生产及在畜牧养殖业中的应用奠定基础。本实验以健康新鲜猪舌上皮黏膜为实验材料,以GenBank中报道的pBD-1的cDNA序列及载体pET-30a的多克隆位点为基础设计引物,其中上游引物含有BamHI酶切位点,下游引物含有Xhol酶切位点。采用RT-PCR方法扩增出pBD-1基因,将其克隆到pMD18-T载体中进行序列测定。通过BamHI和Xhol限制性内切酶酶切重组质粒pMD18-T-pBD-1获得编码成熟肽pBD-1基因,大小为126bp,然后插入到pET-30a载体的BamHI和Xhol位点,构建重组表达质粒pET-30a-pBD-1;重组表达质粒转化到大肠杆菌Roseetta (DE3)中,经测序鉴定,成功构建pBD-1的融合表达系统。阳性克隆菌经摇瓶发酵和IPTG诱导,菌液破碎后进行Tricine SDS-PAGE分析,融合蛋白纯化,酶切去除His标签,蛋白复性,最后利用琼脂孔穴扩散法检测抑菌活性。结果表明,融合蛋白His-pBD-1以可溶性的形式进行表达,蛋白纯化后经Bradford法测定1L菌液可表达约50mg的融合蛋白；蛋白复性后,His-pBD-1和pBD-1蛋白均表现出对链球菌良好的抑菌活性,可见His标签对pBD-1蛋白的活性没有影响,pBD-1对链球菌的最小抑菌浓度为40±5.2μg/ml。这为进一步的细胞毒性实验、免疫原性检测和抗菌制剂的开发等后续工作奠定了良好的基础。以巴马小猪为对象建立链球菌感染模型,采用定量PCR方法,测定感染后不同时间点猪舌上皮黏膜中pBD-1表达量。结果表明,染菌后3h pBD-1的表达水平显著提高(p<0.001),且在6h达到最高水平,染菌后12h其表达水平恢复正常。链球菌刺激对猪舌上皮黏膜中pBD-1的表达有增量调节作用。