论文部分内容阅读
规律成簇的间隔短回文重复序列（CRISPR）与CRISPR相关蛋白（Cas）,提供原核生物获得性、可遗传的免疫保护,以抵抗外源DNA的入侵。这种免疫防御已在不同亚型CRISPR-Cas系统中被证实,与CRISPR阵列中免疫记忆的形成密切相关,称为CRISPR适应阶段或spacer的获取。Ⅱ-C亚型CRISPR-Cas系统是Ⅱ型系统中最常见的亚型,然而这个亚型系统很少被研究。前期研究发现,鸭疫里默氏菌CH-2株（RA-CH-2）编码Ⅱ-C型CRISPR-Cas系统。本论文对该亚型系统的特征、spacer的获取（适应阶段）及抵御外源DNA（干扰阶段）进行了研究。主要结果如下:1鸭疫里默氏菌CRISPR-Cas系统生物信息学分析对RA-CH-2株基因组（NC020125.1）的CRISPR-Cas分析,可以确定CRISPR阵列与cas9、cas1和cas2基因序列,及预测的leader序列与tracRNA序列,其结构为5’-tracRNA-cas9-cas1-cas2-leader-repeat1-spacer1···spacer15-repeat16-3’,表明RA-CH-2株CRISPR-Cas系统属于Ⅱ-C亚型系统。2鸭疫里默氏菌CRISPR-Cas系统适应阶段必需基因研究分别构建RA-CH-2株cas1、cas2和cas1-cas2基因缺失株,并转入穿梭质粒。检测结果表明RA缺失cas1或cas2后丧失对spacer的获取能力,当单基因缺失株携带的穿梭质粒同时表达Cas1与Cas2使其丧失的spacer获取能力能够得到恢复;对Cas1的E149、H206和E221位氨基酸定点突变为丙氨酸后其spacer的获取能力丧失。因此cas1和cas2是RA CRISPR-Cas系统的必需基因,E149、H206和E221位氨基酸是RA Cas1的功能位点。3鸭疫里默氏菌Cas1与Cas2蛋白体外相互作用研究分别构建RA-CH-2株Cas1、Cas2和Cas1-Cas2原核表达重组质粒及其相应表达菌,制备兔抗Cas1重组蛋白的多克隆抗体。IPTG诱导表达BL21pET30a::cas1-cas2与Cas1定点突变表达菌并超声破碎,获得的上清分别进行Ni-NTA pull-down试验与免疫共沉淀试验,以分析Cas1与Cas2体外相互作用。结果表明RA Cas1与Cas2能直接相互作用,并形成稳定的复合物;当Cas1的E149、H206和E221位氨基酸突变成丙氨酸后并不影响与Cas2的相互作用。4鸭疫里默氏菌Cas1降解dsDNA的核酶活性研究将纯化的Cas1重组蛋白与dsDNA进行孵育,在Mg2+、Mn2+、Ca2+、Fe3+、Zn2+、Co2+、Ni2+、Cu2+和Ba2+分别存在的情况下,在不同KCl浓度的反应体系中,检测Cas1蛋白的DNA酶（DNase）活性;对Cas1的E149、H206和E221位氨基酸突变成丙氨酸后分析其DNase活性。结果表明,Cas1重组蛋白能够降解环状/线性dsDNA,Mg2+、Mn2+、Co2+和Ni2+辅助Cas1蛋白切割dsDNA,Cas1核酶对金属离子的偏好依赖于盐离子浓度。当反应体系中Mg2+、Mn2+、Co2+和Ni2+被EDTA螯合后,Cas1蛋白的DNase活性受到抑制;E149、H206和E221位氨基酸突变后Cas1蛋白的DNase活性受到抑制。因此,RA Cas1蛋白是一个依赖于金属离子(Mg2+、Mn2+、Co2+和Ni2+)的核酶,E149、H206和E221位氨基酸是Cas1的核酶活性位点。5鸭疫里默氏菌Cas9参与CRISPR-Cas系统适应阶段研究通过基因缺失、氨基酸定点突变等对RA Cas9参与CRISPR-Cas适应阶段的作用进行评估。（1）构建RA-CH-2株cas9基因缺失株,并分别转入含cas9/cas1-cas2/cas1-cas2-cas9基因的穿梭质粒或空质粒,检测结果表明cas9的缺失使RA获取spacer的能力丧失,因此cas9是RA CRISPR-Cas系统适应阶段的必需基因;当Δcas9携带的穿梭质粒同时表达Cas1、Cas2与Cas9时,缺失cas9基因的RA即可恢复对spacer的获取能力。（2）对预测的Cas9核酶活性位点D8与（或）H792进行丙氨酸替代后,其获取spacer的能力反而增强,表明预测的Cas9核酶活性对RA CRISPR-Cas系统适应阶段是不必要的。6鸭疫里默氏菌CRISPR-Cas系统干扰阶段研究质粒丢失试验及噬菌体感染试验用以评估RA CRISPR-Cas系统对外源DNA的抵御。（1）cas1、cas2或cas1-cas2基因缺失后RA质粒丢失率均显著下降,表明RA CRISPR-Cas系统活跃的适应阶段有助于对质粒DNA的干扰。（2）cas9基因缺失后RA质粒丢失率显著下降,表明RA Cas9参与CRISPR-Cas系统对质粒DNA的干扰。（3）携带pLMF03::cas1-cas2-cas9质粒的Δcas9,若质粒上cas9同时引入D8A和H792A突变时,质粒丢失率显著下降,表明D8和H792位氨基酸是RA Cas9干扰质粒DNA的功能位点。（4）携带pLMF03::cas1-cas2-cas9质粒的Δcas9,与噬菌体混合培养8 h后从衰亡期转变为对数生长期,菌株恢复生长;当质粒上的cas9基因同时引入D8A和H792A突变时,与噬菌体混合培养4 h后进入衰亡期。表明RA Cas9是CRISPR-Cas系统抵抗噬菌体的关键元件,D8和H792位氨基酸是RA Cas9的功能位点。（5）分离到一株噬菌体不敏感的RA-CH-2突变株,该菌株的CRISPR1阵列中整合有匹配噬菌体DNA的新spacer,并逃脱噬菌体的感染,表明RA CRISPR-Cas系统提供对噬菌体的抵抗力。综上,cas1、cas2和cas9是鸭疫里默氏菌Ⅱ-C型CRISPR-Cas系统获取spacer的必需基因。Cas1蛋白能降解双链DNA,其核酶活性是系统获取spacer所必需的。Cas9的D8和H792位氨基酸是系统抵抗质粒与噬菌体DNA入侵必不可少的,但对获取spacer却不是必需的。CRISPR-Cas系统通过整合与噬菌体DNA匹配的新spacer,使得RA能够逃脱噬菌体的感染和裂解。研究结果初次阐释了鸭疫里默氏菌CRISPR-Cas系统的结构、功能以及抵御外源DNA入侵的免疫机制。