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为探讨中草药治疗乙型肝炎的新方法，我们用自己建立的广西麻鸭乙肝感染模型，对荔枝核、茛芀花和罗浮粗叶三种中药材的抗病毒及护肝作用进行了评价。结果发现，高剂量荔枝核水提物能明显抑制鸭乙型肝炎病毒的复制，而荔枝核醇提物和低剂量荔枝核水提物没有明显抑制鸭乙型肝炎病毒的作用;荔枝核水提物和醇提物降低AST和ALT活性均不明显。茛芀花醇提取物和罗浮粗叶木提取物均未见有抑制鸭乙肝病毒复制的作用。高剂量茛芀花醇提物对鸭乙肝病毒引起的肝损伤具有一定的保护作用。罗浮粗叶木提取物对鸭乙肝病毒引起的肝损伤保护作用不明显。 第一部分荔枝核抗鸭乙肝病毒及护肝作用的实验性研究 目的:乙型肝炎是我国最常见的传染病之一，严重危害人民的生命和健康。荔枝是广西最常见的水果之一，本研究拟探讨荔枝核提取物对鸭乙型肝炎病毒的疗效，评价其将来作为治疗人乙型肝炎的可能性。 方法: 1、用蒸馏水和95％乙醇提取物对荔枝核分别进行水提和醇提。2、建立鸭乙型肝炎病毒DNA荧光定量PCR检测方法，并评估检测值和鸭乙型肝炎病毒DNA的敏感性，特异性，重复性，线性度和线性范围。3、鸭子乙肝动物模型的建立:将乙型肝炎病毒DNA阳性血清0.15毫升注入每只1日龄雏鸭的腹腔。采用分层随机抽样方法，将人工感染乙型肝炎病毒的动物随机分配到六组。五个治疗组分别给予高剂量(1.4g/kg)荔枝水提取物，低剂量荔枝核水提取物(0.35g/kg)，高剂量的荔枝核醇提取物（0.7克/千克·天），低剂量荔枝核乙醇提取物（0.18g/kg日）和阳性对照药物阿昔洛韦(ACV)，模型对照组（给蒸馏水）。观察治疗前和治疗后5天，10天及停药后4天实验动物血清中乙型肝炎病毒的DNA，ALT和AST水平的动态变化，并最终进行动物肝脏病理检查。对DHBV DNA和ALT和AST的测试数据，使用使用重复测量资料方差法分析法，而用于判断肝脏疾病严重程度的数据，则应用列联表卡方检验进行统计分析，数据处理和分析使用Windows统计软件SPSS11.5软件。 结果: 1、荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA的方法，该方法具有敏感性好，特异性高，重复性好，线性范围广泛的优势。检测下限在6.93×103至6.93×102拷贝之间; 2、雏鸭感染HBV后14天内，乙型肝炎病毒DNA显示随着时间的推移呈下降趋势。阿昔洛韦组和高剂量的荔枝水提取物组，相比模型对照组，治疗后乙型肝炎病毒DNA的水平明显下降，表明ACV和高剂量的荔枝核水提取物能抑制乙型肝炎病毒复制，其余治疗组与对照组无显着性差异。高剂量的荔枝核水提取物，其抑制病毒效果和ACV类似，但阿昔洛韦治疗组在停药四天后病毒载量大幅反弹，而高剂量的荔枝核水提物组反弹并不明显。 3、经过治疗，高剂量水提取物组ALT活性水平比对照组动物低，但由于整个观察期间的六组动物的的ALT均在正常范围内。因此，不能认为是高剂量的荔枝核水提取物能显着降低ALT活性。其余治疗组和模型对照组比较，ALT活性变化趋势差异不显着。6组动物的AST活性也基本上在正常范围内，并且AST的变化在各组差异不显着，因此也基本可以认为药物降低AST活性不明显。 4、肝脏病理检查发现，在六组动物肝脏疾病的严重程度无显着性差异。表明荔枝核提取物可能没有保护肝组织的作用。 结论: 高剂量的荔枝水提取物能显著抑制鸭乙型肝炎病毒，而荔枝醇提取物（不管是高剂量还是低剂量）及低剂量荔枝水提取物没有显著抑制鸭乙型肝炎病毒的作用;未能证实荔枝核水提取物和乙醇提取物可降低ALT和AST水平，病理学检查也未发现荔枝核的护肝功能。 第二部分茛芀花抗鸭乙肝病毒作用的实验性研究 目的:茛芀花是一种非常重要的药用红树植物，在中国民间当中常将捣碎的茛艿花根与蜂蜜混合后服用，以便对乙型肝炎进行治疗。但有关茛芀花的确切临床疗效如何尚未有科学评价，其抗乙肝病毒效果也未见的有相关的实验研究报道。本研究旨在用自己建立的鸭乙肝动物模型来评价茛芀花的抗病毒作用和护肝效果。 方法:(1)茛芀花乙醇提取物制备:用70％的乙醇浸泡茛芀花。Bliss法测定急性毒性，计算LD50。(2)观察茛芀花乙醇提取物的抗鸭子乙型肝炎病毒的作用:经过强阳性鸭子乙型肝炎病毒DNA血清0.2毫升在腹腔注射1日龄雏鸭，15天后筛选出DHBV阳性鸭（用FQ-PCR检测方法），建立人工鸭乙型肝炎病毒感染动物模型。采用分层随机抽样方法，将人工感染乙型肝炎病毒的动物，随机分成五组。四个治疗组分别给予茛芀花高剂量乙醇提取物(2.0g/kg)，茛芀花中剂量组乙醇提取物(1.0g/kg)，茛芀花低剂量乙醇提取物（0.5克/千克·天）和阳性对照药物阿昔洛韦(ACV)治疗，另外设一组模型对照组（不给药物，给蒸馏水）和一个正常对照组（PCR检测乙型肝炎病毒阴性鸭作为正常对照组，灌服双蒸水）。每组12只动物，各组雏鸭灌服药物14天。于治疗前(T0)和治疗后7天(T7)，治疗后14天(T14)，停药后5天(P5)收集血液样本，用FQ-PCR法检测血清中鸭乙型肝炎病毒DNA含量，酶联免疫吸附法测定血清DHBsAg，DHBeAg0D值，同时检测血清转氨酶(ALT，AST)，停药后处死动物，做肝脏病理检查。(3)数据分析:鸭乙型肝炎病毒DNA，DHBsAg和DHBeAg，ALT和AST数据采用重复测量的方差方法分析，药物对鸭肝脏病理的保护效果选用次和经验分析。数据处理和分析采用SPSS13.0和PEM3.1统计软件。 结果: 1.急性毒性实验结果表明，茛芀花对小鼠的LD50为20.04g/kg。95％可信区间17.66～22.74g/kg，表明茛芀花乙醇提取物处于一种无毒的级别。 2.茛芀花乙醇提取物对鸭乙型肝炎病毒(DHBV)的抑制作用: (1)治疗后，血清鸭乙型肝炎病毒DNA水平仅ACV组比模型对照组显着降低(P＜0.01)，茛芀花的的三个剂量组与模型组均无显着性差异，表明茛芀花乙醇提取物没有直接抑制乙型肝炎病毒的作用。 (2)治疗后，治疗组与模型组相比，血清DHBsAg，在DHBeAg OD值差异没有统计学意义(P＞0.05)。茛芀花乙醇提取物没有降低血清DHBsAg和DHBeAg活性的作用。 (3)治疗后，在降低ALT活性的功能方面，阿昔洛韦、中剂量和高剂量组的茛芀花乙醇提取物，比模型对照组差异有统计学意义(P＜0.01);还发现，在降低AST方面，阿昔洛韦和茛芀花高剂量醇提取物较模型对照组功能要强(P＜0.01)。这些结果表明，ACV和茛芀花的乙醇提取物能降低血清ALT，AST水平，改善肝功能，这些功能的大小和茛芀花酒精提取物剂量及用药时间长短有关。 (4)肝脏病理检查发现，高剂量组的茛艿花提取物和阿昔洛韦对乙型肝炎病毒引起的肝损伤的有明显的保护作用(P＜0.01);其余治疗组与模型组比较，无显着性差异。 结论: (1)提取的茛芀花酒精提取物的LD50为20.04g/kg，处于无毒级。 (2)茛芀花乙醇提取物对鸭乙型肝炎病毒引起肝功能损害具有明显的保肝作用，作用大小具有剂量相关性。没有发现茛芀花乙醇提取物有抑制乙型肝炎病毒的作用。 第三部分罗浮粗叶木抗鸭乙肝病毒及其护肝作用的实验性研究 目的: 罗浮粗叶木在福建、广东等民间被广泛用于治疗病毒性肝炎的治疗，但其治疗效果如何，没有严格科学意义上的临床评价，也没有这种药材的动物实验治疗效果评价。因此，本研究旨在利用我们自己建立的广西麻鸭乙型肝炎病毒感染模型，对罗浮粗叶木醇提取物治疗效果包括抗病毒效果和护肝效果两个方面进行评价。 方法: 罗浮粗叶木醇提物的制备:用70％乙醇提取。急性毒性试验:为了计算动物实验所需要的药物剂量，我们采用改良孙氏寇氏法测定毒性并计算半数致死量LD50。病毒接种及治疗观察:用0.2m1DHBV DNA强阳性血清，注射至刚孵化1日的雏鸭腹腔，15天后采血用荧光定量PCR筛选出DHBV强阳性鸭子，建立人工感染鸭HBV的动物模型。将人工感染DHBV的雏鸭随机分配到5个组。其中4个组给予治疗分别是高剂醇提物组（2.86g/kg·日）、中剂量醇提物组（1.43g/kg·日）、低剂量醇提物组（0.72g/kg·日）和阳性对照药物阿昔洛韦(ACV)治疗组，另设1组模型对照，以双蒸水代替药物。再另设1组正常动物组(DHBV阴性)，也给予等量的双蒸水。每组12只动物，各组雏鸭均灌胃14天。于灌药前(T0)、灌药后7天(T7)、灌药后14天(T14)、停药后5天(P5)分别采血，采用荧光定量PCR方法检测血清中DHBV DNA的载量，用ELISA法测定DHBsAg的0D值，同时检测血清中的转氨酶(AST，ALT)，最后处死动物，做肝脏病理学检查。数据分析:采用重复测量资料方差分析方法，分析DHBVDNA、DHBsAg、 ALT与AST的有关检测数据，药物对鸭肝病理影响的数据，则采用秩和检验进行分析。数据处理分析均采用SPSS13.0 forwindows统计软件。 结果: 研究过程中仅ACV组的病毒载量低于模型组（P=0.043），提示ACV能抑制DHBV的复制，但从14天开始到停药5天，DHBV载量出现反跳。比较各治疗组与模型组病毒载量，发现它们随时间变化的趋势都比较相近，差异无统计学意义（P＞0.05），罗浮粗叶木醇提物高、中、低三个剂量的治疗组，都未显示出明显的抑制DHBV的作用。本实验中1.2kg罗浮粗叶木生药制得醇提物3029，经口急性毒性实验发现其对小鼠的LD50为22.91g/kg，95％可信区间处于21.41～24.51g/kg之间（孙氏改良寇氏法），属于无毒级。观察期内，正常动物组的鸭乙肝表面抗原OD值明显低于治疗组及模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）;各治疗组与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），说明本实验中罗浮粗叶木醇提物的三个剂量组，都没有抑制鸭乙肝表面抗原表达的作用。观察期内，各个时点治疗组及模型组的ALT和AST数值均明显高于正常组，差异有统计学意义(P＜0.05);各治疗组与模型组比较，差异没有统计学意义（P＞0.05），提示罗浮粗叶木醇提物的高中低三个剂量，都没有降低ALT、AST水平以及改善肝功能的作用。肝脏病理检查发现，三个剂量醇提物治疗组的肝组织病变并没有明显改善（比较模型组，P＞0.05），提示罗浮粗叶木没有保护作用。 结论: 罗浮粗叶木醇提物没有抑制DHBV复制的作用。罗浮粗叶木醇提物对DHBV引起的肝损伤没有保护作用。