【摘 要】
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目的探究肺炎克雷伯菌cAMP受体蛋白(cAMP receptor protein,CRP)对基因allS的调控关系及机制。方法首先,PCR扩增allS的启动子区序列,扩增产物进行纯化,酶切连接入placZ15质粒
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目的探究肺炎克雷伯菌cAMP受体蛋白(cAMP receptor protein,CRP)对基因allS的调控关系及机制。方法首先,PCR扩增allS的启动子区序列,扩增产物进行纯化,酶切连接入placZ15质粒,构建得到重组质粒,将重组质粒分别转入肺炎克雷伯菌CCW01(缺失lacZ基因)和CCW01:△crp(缺失crp基因)中。通过测定CCW01和CCW01:△crp的β-半乳糖苷酶活性,并用统计学方法分析数值结果,确定调控子CRP对allS基因的调控关系。运用RT-PCR逆转录肺炎克雷伯野生株和突变株△crp RNA为cDNA后比较all S基因在野生株和突变株△crp中的表达量来进一步验证CRP对allS的调控关系。表达纯化出有活性的His-CRP蛋白,然后经PCR扩增allS启动子区的DNA序列,通过凝胶阻滞实验确定CRP是否能结合到all S的启动子区,通过应用DNaseⅠ足迹实验鉴定CRP在allS启动子区的具体结合位点。结果lacZ报告基因融合实验显示CRP对allS具有正调控作用。实时定量RT-PCR显示突变株△crp中allS基因表达量明显低于野生株,进而验证了LacZ报告基因融合实验所得结果的正确性。凝胶阻滞实验和DNaseⅠ足迹实验进一步表明CRP能直接结合到allS启动子区的-94到-60之间的碱基序列上(转录起始位点为+1)。结论CRP调控子可以结合到allS的启动子区并促进allS基因的转录。本研究首次探索了肺炎克雷伯菌转录调控子CRP对allS的调控机制,为进一步研究肺炎克雷伯菌CRP的转录调控网络及基因allS在肺炎克雷伯菌中的作用奠定了基础。
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