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血橙是柑橘中唯一含有花青素类色素的优良栽培品种，因果肉带有似血颜色的深红色汁液及果皮具有紫红色斑纹而得名。血橙因果实富含花青素，不仅使其具有很高的营养价值，而且赋予果实诱人的色泽，因此它既是深受人们喜爱的鲜食柑橘品种，也是柑橘果汁加工的上佳原料。作为血橙重要的品种特征和经济性状，血橙中花青素合成机制的探明在理论和应用均具有重要的价值。而有关血橙花青素合成的分子调控机制尚不清楚，更缺乏转录因子参与调控血橙花青素合成酶基因表达的直接证据。 本文针对前人提出的转录因子CsMYC2可能是调控血橙花青素合成酶基因表达的转录因子的假设，以血橙(Citrus sinensis(L.) Osbeck)中的主要栽培品种塔罗科血橙为实验材料，通过克隆CsMYC2的基因序列并进行结构域、核定位和转录激活活性来确定其是否具有bHLH(MYC)类转录因子的特征和启动子功能;通过凝胶迁移阻滞分析实验(EMSA)来考查其是否与血橙花青素合成途径的合成酶基因发生特异性结合，经过研究本文获得了下列主要结果和结论: 1.从塔罗科血橙果肉中提取RNA，采用逆转录的方法，获得了转录因子CsMYC2基因的全长cDNA序列。生物信息学分析结果显示，该序列的长度为1971bp，编码656个氨基酸，预测的蛋白质分子量为73.5kDa，等电点为4.87。SOMPA预测其二级结构由42.84％的α-螺旋（Alpha helix），13.11％的延伸带(Extended strand)，8.23％的β转角(Beta turn)，以及35.82％的无规则卷曲(Random coil)组成。蛋白质的三级结构预测结果表明，CsMYC2蛋白具有bHLH蛋白家族典型的碱性-螺旋-环-螺旋结构域。亚细胞定位预测显示，CsMYC2蛋白定位于细胞核中。说明，本文克隆获得的CsMYC2基因序列具有bHLH(MYC)类转录因子的基因结构特征和生物学功能。 2.为了验证CsMYC2蛋白的亚细胞定位，构建了CsMYC2基因和GFP基因的融合基因真核表达载体。通过农杆菌EHA105介导转化洋葱表皮细胞，共培养18h后，在共聚焦荧光显微镜下观察发现CsMYC2蛋白定位于细胞核中。 3.克隆获得了血橙花青素生物合成途径中相关酶基因的启动子序列，包括PCHS、PCH、PF3H、PF3 H、PDFR、PANS和PUF3GT。将CsMYC2基因插入到pGreenⅡ62-SK质粒中，同时将PCHS、PCHI、PF3H、PF3H、PDFR、PANS和PUF3GT插入到具有海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶基因的pGreenⅡ0800-LUC质粒中，构建了用于Dual-Luciferase报告基因检测系统的真核表达载体，并转化拟南芥原生质体。检测结果显示，效应质粒能够提高含PUF3GT和PDFR报告质粒的荧光强度。说明转录因子CsMYC2能够增强UF3GT启动子和DFR启动子的活性。 4.本文构建了插入CsMYC2基因的原核表达载体，并经无细胞表达系统表达并纯化获得了CsMYC2蛋白。体外EMSA实验表明，CsMYC2蛋白能够与UF3GT启动子的MYCCONSENSUSAT2反应元件探针以及DFR启动子的MYCCONSENSUSAT2和MYCCONSENSUSAT3反应元件探针相互结合。说明，转录因子CsMYC2能够通过与UF3GT启动子和DFR启动子直接结合，从而调控这两个基因的表达。 综合上述结果，本文从结构和功能分析上证明了CsMYC2是具有bHLH转录因子的结构特征和表达特点的bHLH家族转录因子，其能够与血橙花青素合成酶基因UF3GT和DFR的启动子发生特异性结合，从而参与血橙花青素合成的调控。本文的研究为CsMYC2是调控血橙花青素合成酶基因表达的转录因子的假设提供了直接证据，为进一步探究转录因子与血橙花青素合成酶基因表达调控关系奠定了实验基础，并将为培育高含量花色素苷血橙新品种提供理论依据和技术支持。