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梅毒是由梅毒螺旋体(又称苍白螺旋体Treponema pallidum,Tp)感染引起的一种全球分布的性传播病,与HIV感染和传播有密切的关系。梅毒在许多发展中国家高度流行,在发达国家社会经济地位较低人群中仍为一重要的公共卫生问题。近年来在我国梅毒的发病率呈逐年上升趋势。目前梅毒血清学检验已列入献血员和临床患者输血前、手术前以及各种创伤性检查前的常规检测项目。长期以来,由于梅毒螺旋体在体外不能人工培养,故在实验室难以对其进行研究,迄今尚无高效的诊断、鉴别诊断方法以及征服该病的疫苗。因此研究新的快速、简便、敏感且特异的诊断方法,尤其是迫切需要发展针对感染梅毒后两周、先天梅毒和神经梅毒的诊断方法,对该病的早期诊断、早期治疗有着重要的意义。
传统的梅毒检测手段主要有梅毒病原体检测法、血清抗体检测法、PCR法等,而目前国内外主要采用血清学快速检测方法,以非特异抗体检测法为初筛,再以特异梅毒螺旋体抗体检测作为确证试验。但这些传统的检测方法一次只能确定或排除一种病原体,不能实现大规模高通量的检测。另一方面,由于人体对外来病原体产生免疫有一定的时滞,这些血清学检测方法对检测梅毒初染阶段、先天梅毒敏感性很低。基因芯片技术为梅毒螺旋体的检测提供一种新的途径。基因芯片检测的对象是DNA或RNA,只要人体内有病原的核酸就能检出,并能同时对多种病原体进行检测,具有明显的优越性。
基因芯片技术根据探针类型分为cDNA芯片和寡核苷酸芯片,近年来的研究表明,寡核苷酸芯片比cDNA芯片有着更高的特异性,同时其灵敏度也能满足目前病原体检测的要求。寡核苷酸芯片的制作既可以采用芯片上原位合成短的寡核苷酸探针的方法,也可以采用合成仪人工合成15～80mer的寡核苷酸探针然后固定在支持物上的方法制备。这两种方法中,后者相对简单易行,且系统的开放性较好。而在探针的长度的选择上,50～70mer的寡核苷酸探针被认为能取得特异性和灵敏度之间的平衡,并且多数情况下只需一个探针即可检测一个基因。
基因芯片具有快速、高效、平行化检测的特点,因此在基因表达谱的基础研究和病原体检测、疾病诊断上的应用研究方面已得到广泛应用。然而基因芯片的临床应用仍然面临很多需要解决的问题,其中芯片的质量控制是一个关键问题,此外多种芯片技术平台得到的研究结果不一致等。
本课题第一部分提出一种新的芯片质控方法:即在探针设计中引入一段特异的通用引物互补序列,以Cy3或Cy5标记的通用引物与该芯片杂交,达到检测芯片制备质量的目的。这部分实验首先在本实验室前期cDNA芯片实验的基础上进行:以HIV-1的4个亚型(B、C、F、G)质粒:HIV1U26942、C2220、FIN9363、HH8793为模型。在cDNA芯片探针的制备中采用限制性显示(RD-PCR)技术,以Sau3A Ⅰ酶切HIV基因,得到若干限制性酶切片段,然后在片段两端接上接头(通用引物UP1互补序列),根据酶切位点、接头的序列设计通用引物,并在通用引物的3’端延伸一个碱基,以此引物进行PCR反应,不仅可以分别扩增若干组片段,而且可以保证每一组探针片段的两端都有一段公共序列。以上述限制性基因探针制备芯片,以Cy3标记的通用引物(Cy3-UP1)与芯片杂交,对照样品为Cy3标记的随机引物(Cy3-RP),比较两者杂交效率。结果:荧光标记的通用引物杂交结果显著优于荧光标记的随机引物杂交结果,在较低浓度就可显示较强的荧光信号(大约相差10倍浓度级)。结果表明,对于不同的探针,都可以通过检测两端公共序列的信息来代表整个探针的信息,从而达到检测芯片制备质量的目的。
进一步,本课题根据上述思路,设计了一种新型寡核苷酸芯片探针:即在50 mer或60 mer靶基因寡核苷酸的一端或两端引入一段公共序列(即连接臂,通用引物UP2互补序列的一部分)。实验中,以HIV基因靶基因,设计了14条连接有不同序列及不同连接方式连接臂的寡核苷酸探针,通过Cy5标记的通用引物(Cy5-UP2)与上述新型寡核苷酸探针制备的芯片杂交,筛选出5条信号强而稳定的探针,其中8号探针杂交信号最强,为最佳质控寡核苷酸探针设计方式。然后,再以筛选出来的5种新型探针制备芯片,与不同浓度梯度的Cy5标记通用引物(Cy5-UP2)和随机引物(Cy5-RP)杂交。结果:20μmol/L、2μmol/L的Cy5-UP2与芯片杂交全部探针杂交出现较强的信号,0.2μmol/L的Cy5-UP2与芯片杂交部分探针也有杂交信号,尤其是8号探针。而2μmol/L、0.2μmol/L的Cy5-RP与芯片杂交基本没有信号。两者荧光信号强度值相比,20μmol/L的Cy5-UP2与芯片杂交信号比20μmol/L的Cy5-RP与芯片杂交信号明显强。结果进一步证实:通过检测寡核苷酸探针中公共序列来实现芯片质控的方法是可行且高效的。
在上述基础上,本课题的第二部分,以梅毒螺旋体基因为对象,利用上述设计方法设计梅毒螺旋体寡核苷酸探针,开展梅毒螺旋体寡核苷酸芯片研制的初步研究。
梅毒螺旋体为苍白密螺旋体苍白亚种,1998年公布的梅毒螺旋体Nichols株全基因组序列有1.138Mb,平均G+C含量为52.8％,有1041个预测的开放阅读框架,平均大小为1023bp,代表92.9％的总基因组DNA。梅毒螺旋体基因组与其它密螺旋体(如雅司螺旋体、地方性梅毒密螺旋体)的同源性超过95％,与伯氏疏螺旋体基因组比较,其中476个开放阅读框架(46％)有进化同源性。梅毒螺旋体基因分型采用Pillay等人应用PCR及限制性片段长度的多态性方法建立的用arp基因与tpr基因二个系统联合对Tp进行分了分型的方法,据国内外报道其主要的优势流行株是14D亚型。
本实验首先在NCBI GenBank中获取梅毒螺旋体尼克尔斯株的全基因组序列(GenBank登陆号NC 000919),通过文献检索及BLAST分析结果发现Pol-A基因、TP47膜蛋白基因(tpp47基因)、Tp92膜蛋白基因(Tp92基因)、Tp15KD脂蛋白基因(tpp15基因)的部分序列为梅毒螺旋体的保守序列,其中PolA和Tpp47具有苍白螺旋体亚种特异性、TP92和Tpp15有密螺旋体属的特异性。使用生物学软件Oligo6.0分别对BLAST分析所得特异性序列进行逐一分析,设计长度均一、各种参数适合的38条长度为50mer的寡核苷酸探针。将其中1、2、7号探针两端加10mer的连接臂(相同于第一章8号寡核苷酸探针)形成具有检测梅毒螺旋体基因芯片制备质量的寡核苷酸探针(即质控探针)。实验采用Tpp47、Pol-A基因的23条探针(包括3条质控探针)为实验探针,固定在环氧基化的玻片上制备芯片。
本课题获得梅毒螺旋体Nichols株的DNA,扩增梅毒螺旋体DNA的Pol-A、Tpp47、TP92和。Tpp15基因后克隆至pMD18-T载体,然后测序鉴定。这些基因片段作为梅毒螺旋体芯片的阳性样品,用以筛选梅毒螺旋体寡核苷酸探针。
进一步,以梅毒螺旋体的PolA和Tpp47基因片段为阳性样品,用本实验室的专利技术--通用引物联合标记法进行Cy3荧光标记。用Cy5-UP2和Cy3标记的样品混合液与芯片进行双色杂交,扫描后获得的两种通道的荧光信号值。前者(即红色)为Cy5-UP2杂交信号,用来检测TP芯片的制备质量；后者(即绿色)为梅毒螺旋体的样品杂交信号,用来筛选特异性的梅毒螺旋体阳性探针。芯片杂交结果显示,检测芯片的质控有效,大部分探针都有杂交信号。根据荧光强度信号值、信噪比筛选出符合要求的敏感性和特异性较高的9条探针,即1、3、7、8、9、11、13、14、16、20和21号探针。利用筛选的探针建立了梅毒螺旋体基因检测芯片系统。
综上所述,本研究结合新型探针设计,探索了一种方便的、有效的检测芯片质量的方法--利用荧光标记的通用引物检测基因芯片的制备质量,并建立了梅毒螺旋体寡核苷酸芯片检测系统,为多病原体联合检测芯片的研究打下基础。