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目的: 监测并分析我市人类免疫缺陷病毒感染者或获得性免疫缺陷综合征患者(HIV/AIDS)合并分枝杆菌感染情况、菌种谱特征及耐药性;提高我市HIV/AIDS合并分枝杆菌病感染的实验室检测能力，为临床确定诊断、流行病学分析及治疗评估提供理论依据。 方法: 利用HIV/AIDS患者的临床样本，包括血液、痰液、脑脊液、尿液、便、胸水、腹水、分泌物以及疑似感染部位的穿刺液等进行分枝杆菌(Mycobacterium)的分离培养及菌种鉴定，并对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)进行一线与二线抗结核药物的敏感性试验。分析在本市就医的HIV/AIDS患者中合并分枝杆菌感染的状况和耐药情况。 1.样本(对象)选择。 研究对象包括2010年7月至2012年12月期问，首都医科大学附属北京佑安医院感染科就诊的HIV/AIDS患者，所有患者HIV/AIDS诊断均符合中华人民共和国卫生部2008年颁布的《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准》。 患者因机会性感染入院，可疑为分枝杆菌感染或症状不典型、病原体诊断不明者，均送检血液、痰液、脑脊液、尿液、便、胸水、腹水、分泌物以及疑似肺外组织感染部位的穿刺液等局部标本。样本共计410人份，其中血液98人份，其它部位样本312人份，同一病人多次标本多次培养按照一人次计算，共计212人。血培养以无菌操作取血液标本直接加入含MFL培养基的血液培养瓶中，混匀后放入BACTEC9120血液培养系统内进行分枝杆菌培养;其它局部标本则先涂片，经过抗酸染色镜检后，同时进行分枝杆菌培养。取阳性培养管里的培养物涂片，经抗酸染色后镜检，共筛选出35株抗酸染色阳性分枝杆菌。 另有首都医科大学附属北京地坛医院以同样方法培养的60株抗酸染色阳性分枝杆菌，两家共计95株抗酸染色阳性标本，在中国疾病预防控制中心结核病预防控制国家重点实验室进行菌种鉴定和药物敏感性试验，经传代培养最终从95株标本中分离出73株有效菌株用于菌种鉴定和药物敏感性试验。 2.试验方法。 2.1、菌种的分离:HIV/AIDS疑似合并分枝杆菌感染患者的痰液、脑脊液、尿液、便、胸水、腹水、分泌物以及疑似肺外组织感染部位的穿刺液等局部标本，先进行涂片和抗酸染色，再按照BACTECTM MGITTM960系统快速液体培养技术的要求，将标本做接种前处理后接种到加了杂菌抑制剂和生长添加剂的MGIT快速培养管中，最后放入BACTECTM MGITTM960仪器的孵育抽屉进行培养，同时平行接种一支改良罗氏(L-J)培养基进行分枝杆菌分离培养。血液标本直接加入含MFL培养基的血液培养瓶中混匀，放入BACTEC9120血液培养系统内进行分枝杆菌分离培养。BACTECTM MGITTM960快速培养系统和BACTEC9120血液培养系统灵敏的连续荧光探测技术通过测定伴随分枝杆菌生长所引起的O2浓度和CO2浓度的变化以监测培养管内分枝杆菌生长状态，二者均有自动报告阳性的功能，前者培养阳性标本检出时间平均为9.0天，后者平均报阳时间为30.0天。如培养至第42天时仍无阳性报警，则机器自动判定为培养阴性，取出阴性培养物，经过涂片及抗酸染色鉴定确无抗酸分枝杆菌生长，再将培养瓶及培养物消毒后统一处理。改良罗氏(L-J)培养管培养观察8周，如无抗酸分枝杆菌生长，则视为培养阴性。取三种方法培养阳性的培养物涂片，进行抗酸染色，用抗酸染色阳性的培养物留取菌种，-20℃冻存备用。 2.2、菌种的鉴定:根据分支杆菌对某些药物的耐受性不同，利用对硝基苯甲酸(Para Nitro Benzoic Aci，PNB)/噻吩-2-羧酸肼(Thiophene-2-carboxylic acid hydrazine medium，TCH)鉴别培养基培养法将分枝杆菌初步分为3种:人结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tubercμlosis，MTB)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)和非结核分枝杆菌(Nontubercμlosis mycobacteria，NTM)。并使用多位点PCR方法从分子水平对上述结核分枝杆菌进行菌种确证。 2.3、比例法药物敏感性试验:选用四种一线药物:异烟肼(isoniazid、INH)，利福平(rifampicin、RFP)，链霉素(streptomycin、SM)，乙胺丁醇(ethambutol、EMB)和四种二线药物:卷曲霉素(capreomycin、CPM)，卡那霉素(kanamycin、K)，氧氟沙星(ofloxacin、OFLX)，丙硫异烟胺(prothionamide、PTH/Et)。所选的8种抗结核药物均为美国Sigma公司生产，都在使用有效期内。根据每种药物的特性选取相应的药物溶解剂及稀释剂，配置出8种药物的所需药物母液浓度，按照每种培养基所需含药浓度分别加入中性改良罗氏(L-J)培养管内，制备成8种药敏培养基。 分别刮去生长在改良罗氏(L-J)培养基上2周左右的73株有效分枝杆菌菌落，放入含有玻璃珠、螺口、密闭的磨菌瓶底部，加入3-4滴无菌10％吐温水溶液，充分震荡研磨均匀，与McFarland标准比浊管比浊，以灭菌生理盐水稀释制备成10-2mg/ml和10-4mg/ml的两种浓度结核分支杆菌菌悬液，以划线法将菌悬液分别接种到上述8种药敏培养基，每种药物接种两管不同浓度的菌悬液。同时选用不加药物的中性改良罗氏(L-J)培养基设为阴性对照，以结核分枝杆菌标准株H37Rv设为阳性对照，接种后的培养基放置37℃恒温箱孵育培养。接种后第3日观察一次，以后每周观察1次，正常对照培养基菌落生长丰满、形态良好，阴性培养基无菌落生长，观察2个月为止。 结果: 1.菌株的分离:从98人份血液标本中，分离出11株抗酸染色阳性分枝杆菌，阳性率为11.22％(11/98);其余312人份局部标本，分离出抗酸试验阳性分枝杆菌28株，阳性率为8.97％(28/312)。其中有4株为痰液和血液重复培养阳性，将其按照重复样本计算后，共分离出35株非重复性分枝杆菌。 2.菌种鉴定:在73株有效分枝杆菌菌株中，经PNB、TCH鉴定与多位点PCR基因分型，显示分离菌株中包括MTB66株，占90.41％(66/73)，NTM7株占9.59％(7/73)。其中7株非结核分枝杆菌经hsp65引物扩增测序后，筛选出4株鸟分枝杆菌、2株堪萨斯分枝杆菌、1株胞内分枝杆菌。 3.药物敏感性实验。 3.1、对66株结核分枝杆菌的耐药检测。 对8种抗结核药物的耐药结果统计为: 一线药物:异烟肼(INH)33.33％、利福平(RFP)19.70％、链霉素(SM)45.45％、乙胺丁醇(EMB)12.12％，总耐药率为63.64％。 二线药物:卷曲霉素(CPM)50.00％、氧氟沙星(OFLX)22.73％、卡那霉素(K)24.24％、丙硫异烟胺(PTH/Et)9.09％，总耐药率为59.09％。 根据对8种抗结核药物的耐药数量分析:耐8种药物的有2株，耐7种药物的有2株，耐6种药物的有0株，耐5种药物的有3株，耐4种药物的有5株，耐3种药物的有13株，耐2种药物的有11株，耐1种药物的有18株。对8种药物都敏感的有12株。本研究共分离出耐多药结核分枝杆菌(multi-drugsresistant mycobacterium tuberculosis, MDR-TB)15株，耐多药为22.73％;分离广泛耐药性结核分枝杆菌(extensively drug-resistant mycobacterium tubercμlosis，XDR-TB)5株，广泛耐药率为7.58％。 3.2、对6株非结核分枝杆菌的耐药检测。 8种抗结核药物的耐药结果统计为: 一线药物:异烟肼(INH)66.67％、利福平(RFP)83.33％、链霉素(SM)100.00％、乙胺丁醇(EMB)100.00％。总耐药率为100.00％。 二线药物:卷曲霉素(CPM)100.00％、氧氟沙星(OFLX)83.33％、卡那霉素(K)83.33％、丙硫异烟胺(PTH/Et)66.67％。总耐药率为100.00％。 根据对8种抗结核药物的耐药数量分析:耐8种药物的有1株，耐7种药物的4株，耐5种药物的1株。对8种药物都敏感的有0株。6株非结核分枝杆菌即属于多耐药又属于广泛耐药，耐多药率和广泛耐药率为均为100.00％。 结论: 1.综合本市就诊的HIV/AIDS患者合并分枝杆菌的感染的菌种鉴定结果分析，本市就诊的HIV/AIDS患者合并分枝杆菌的感染主要以结核分枝杆菌感染为主，同时有9.59％的非结核分枝杆菌感染率，应引起重视。 2.HIV/AIDS合并分枝杆菌感染患者分枝杆菌的耐药状况非常严重，耐多药性结核分枝杆菌(MDR-TB)和广泛耐药性结核分枝杆菌(XDR-TB)在HIV/AIDS合并分枝杆菌感染患者中产生现象严重，分枝杆菌对一线药物和二线药物的总耐药率都非常高。当有非结核分枝杆菌感染时，抗结核一线药物和二线药物几乎没有抗菌作用。应加强对我市就诊的HIV/AIDS合并分枝杆菌感染的监测，规范治疗方案。 3.从来自北京佑安医院的312人份局部标本直接涂片抗酸染色镜检观察到的抗酸阳性分枝杆菌仅4株，培养分离出抗酸阳性分枝杆菌28株，说明直接涂片法对HIV/AIDS合并分枝杆菌感染患者局部标本分枝杆菌检出敏感性较低。 4.HIV/AIDS合并分枝杆菌的感染的菌种分离目前虽没有统一的标准，但是应用液体快速培养、改良罗氏(L-J)培养基培养、血液培养等多种方法培养，对培养物涂片抗酸染色，能快速分离出分枝杆菌，结合分子生物技术对菌株进行菌种鉴定，对临床治疗有积极意义。