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前言与目的：由于颅内恶性肿瘤具有侵润性生长的特性,目前治疗手段如手术、放疗、化疗等难以完全清除侵润到周边正常脑组织中的肿瘤细胞,而正是周边侵润的肿瘤细胞导致肿瘤的复发,且放化疗副作用大,效果不佳,预后极差。
随着分子生物学的发展,基因治疗已成为人们关注的新的治疗手段,其中单纯疱疹病毒腺苷激酶/更昔洛韦系统(herpes simplex virus-thymidine kinase/ganciclovir,HSV-tk/GCV)是最有希望,研究最广泛的策略之一。其原理是在肿瘤细胞中导入tk基因,tk基因表达的腺苷激酶可以将无毒的更昔洛韦在肿瘤局部磷酸化为一磷酸核苷,后者在细胞内激酶作用下转变为二磷酸核昔,再继续磷酸化为具细胞毒性的三磷酸核苷,抑制多聚酶活性,并竞争性掺入细胞DNA链中,引起碱基配对错误、断裂,阻碍DNA复制,抑制细胞分裂,最终导致细胞死亡。由于有毒药物只在肿瘤局部发挥作用,毒副作用小,其临床应用的安全性已得到证实,但临床实验中对肿瘤的治疗效果并不佳,患者生存期并没得到延长。因为细胞外的病毒载体只能靠被动扩散,无法移动到离接种点太远的距离,而胶质瘤细胞能侵袭到很远的区域。
神经干细胞具有向多种颅内恶性肿瘤细胞迁移的特性,是基因治疗的理想载体。在我们以前的研究中,我们使用原代培养的神经干细胞做载体,介导HSV-tk/GCV系统对胶质瘤C6细胞做治疗,在体内外实验中均取得了令人鼓舞的效果。本实验中我们进一步使用永生化的神经干细胞C17.2做载体,研究其对颅内恶性肿瘤的杀伤作用。与原代培养的干细胞相比,其性质更加均一、稳定,实验可重复性更强。
在HSV-tk/GCV自杀基因治疗中还存在一种机制,“旁观者效应”,当给予更昔洛韦时,导入tk基因的“阳性细胞”周边的未导入tk基因的“阴性细胞”也会被一同杀死。旁观者效应的存在进一步增强了HSV-tk/GCV系统对肿瘤的杀伤作用。虽然其具体机制尚不明确,但日前大多认为旁观者效应的物质基础是细胞间缝隙连接(GJ),GJ由细胞膜上的同类连接蛋白(Connexin,Cx)构成。自杀基因产物通过细胞间的缝隙连接(GJ)到达邻近细胞,引起肿瘤细胞死亡。胶质瘤中最主要的是Cx43,但在肿瘤细胞中Cx的表达往往较少或者缺失,导致旁观者效应低下,HSV-tk/GCV系统抗肿瘤效果不佳。本研究中,我们使用全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)诱导C6细胞中Cx43的表达,实验证明,ATRA能进一步增加C6细胞间Cx43的表达,增强HSV-tk/GCV系统对C6细胞的杀伤作用。
材料与方法：
(一)实验材料永生化神经干细胞系C17-2由徐海伟教授惠赠(中国第三军医大学生理学教研室)。C6、Daoy细胞系购自ATCC(American Tumor Cell Collection),融合了潮霉素磷酸转移酶基因和1型单纯疱疹病毒腺苷激酶基因的质粒tgCMV/HyTK由中国广州生物医学公司提供。DMEM、胎牛血清、马血清购自Gibco公司。潮霉素B、MTT、DMSO、ATRA、罗氏黄购自Sigma公司,Lipofectamine TM2000购自Invitrogen公司,BALB/c雄性裸鼠购自中国医学研究院动物研究所。兔多克隆抗体Cx43,β-actin购自Santa Cruz公司。山羊抗兔辣根过氧化物酶标记IgG购自中国北京博奥森生物技术有限公司。
(二)实验方法
1、细胞培养永生化神经干细胞系C17.2使用DMEM+10％胎牛血清+5％马血清条件培养基,Daoy、C6细胞使用DMEM+10％胎牛血清条件培养基,所有细胞均在5％CO2,37℃条件下培养。
2、细胞的转染与筛选对数生长期的C17.2细胞接种于6孔板,细胞贴壁后更换为不含血清的DMEM,加入tgCMV/HyTK和Lipofectamine TM2000,然后加潮霉素B进行筛选,挑选有潮霉素抗性的C17.2-tk单克降细胞分别培养,在以后的实验中应用。
3、转染后鉴定取对数生长期C17.2-tk细胞株接种于96孔板,加入含不同浓度GCV的培养液,7天后检测细胞存活率,未转染的C17.2细胞做对照。
4、C17.2-tk在体外埘肿瘤Daoy细胞的杀伤作用C17.2-tk与Daoy细胞按不同比例混合,给予不同浓度的GCV,7天后MTT法观察其对Daoy细胞的杀伤作用。
5、C17.2-tk对Daoy细胞的体内杀伤作用应用脑立体定向注射仪,将Daoy细胞、转染后的C17.2细胞或两者按不同比例混合的细胞定向注入裸鼠脑内特定位置(前囟后方0.2mm,右侧2mm,硬膜下4mm)。给予生理盐水对照或GCV,一段时间后猝死,固定脑组织,切片,H-E染色,应用NIH图像分析软件(rsbweb.nih.gov)计算肿瘤组织体积。同样方法做另一组裸鼠,观察其生存期。
6、Daoy、C17.2细胞中Cx43的表达Western-blot检测:细胞用裂解液处理,BCA法蛋白定量,聚丙烯酰胺凝胶电泳,转到PVDF膜上,5％脱脂奶粉封闭2小时,Cx43及β-actin分别作为一抗反应12小时,辣根过氧化酶标记的IgG作为二抗反应2小时,化学发光法检测Cx43的表达。
免疫荧光检测:细胞在盖玻片上长成单层,用4％的多聚甲醛固定,10％的马血清封闭30分钟,Cx43抗体孵育,山羊抗兔辣根过氧化物酶标记IgG二抗孵育。PI染色,避光条件下荧光显微镜下观察Cx43的表达。
7、ATRA对C6细胞生长的抑制作用及对C17.2-tk/GCV系统抗肿瘤的增强作用C6细胞接种于96孔板,加不同浓度的ATRA每2天换液一次,5天后MTT法测细胞存活率。C17.2-tk与C6细胞按不同比例混合,单独加入GCV或ATRA联合GCV条件培养液,MTT法测细胞存活率。
8、ATRA增强C6细胞中Cx43的表达ATRA对C6细胞作用3天后,应用染料传输实验、Western-blot检测C6细胞中Cx43的表达。
9、统计学分析所有数据均使用SPSS12.0软件包处理。所有数据均用均数±标准误表示,均数使用单因素方差分析和t-检验,生存期使用时序检验,检验水准α=0.05。
结果：
1、转染后C17.2-tk细胞对GCV敏感性GCV浓度为0.1μg/ml时,与对照组相比C17.2-tk细胞即出现明显死亡;随GCV浓度增加,C17.2-tk细胞死亡逐渐增加,当GCV浓度为1μg/ml时C17.2-tk细胞即全部死亡,而此时未经转染的C17.2细胞生长良好,即使将GCV浓度提高至100μg/ml(是转染细胞的100倍)C17.2细胞仍没有出现明显死亡,两者存在显著差异。
2、C17.2-tk/GCV对Daoy细胞的体外杀伤作用当GCV浓度为5μg/ml时,杀伤作用达到最大,Daoy细胞的存活率为25％,继续提高GCV的浓度不能增强杀伤作用。C1.7.2-tk与Daoy细胞比例低至1:16时,细胞存活率约为75％。
3、C17.2-tk/GCV对Daoy细胞的体内杀伤作用C17.2-tk与Daoy共同接种,并且给腹腔注射GCV,肿瘤体积明显减小,且动物平均生存期明显延长。C17.2-tk与Daoy比例从1:2到1:8,与对照组相比,肿瘤体积明显缩小。C17.2-tk与Daoy比例为1:8时平均生存期与对照组相比生存期仍明显延长。
4、C17.2与Daoy细胞问Cx43表达的检测Western-blot与免疫荧光结果均表明,在Daoy和C17.2细胞中Cx43呈相对低表达,转染HSV-tk基因没有对Cx43的表达造成影响,但当C17.2细胞与Daoy细胞共同培养后Cx43的表达明显增加。
5、C17.2-tk/GCV对C6细胞的体外杀伤作用C17.2-tk与C6细胞比例低至1:16时,仍能对C6细胞的生长产生明显的抑制作用。
6、ATRA增强C17.2-tk/GCV对C6细胞的杀伤作用单独应用ATRA可以对C6细胞产生杀伤作用,HSV-tk/GCV与ATRA联合应用增强了C17.2-tk/GCV对C6细胞的杀伤作用。
7、ATRA增加细胞间Cx43的表达染料传输实验及Western-blot检测结果均证明,联合应用ATRA后,C6细胞间Cx43的表达明显增加。
结论：
1、C17.2稳定转染HSV-tk基因后对GCV具有很高的敏感性。
2、C17.2神经干细胞介导的HSV-tk/GCV系统对颅内恶性肿瘤细胞有明显的杀伤作用。
3、Cx43在Daoy和C17.2细胞中均呈相对低表达,但将两者混合培养后,Cx43的表达明显增加,混合培养后Cx43的高表达可能是治疗效果好的原因。
4、C17.2神经干细胞是HSV-tk/GCV基因治疗髓母细胞瘤的高效的载体。
5、ATRA在很低浓度下即可对C6细胞的增贿产生抑制作用,并且ATRA同时具有增强细胞间缝隙连接蛋白表达的作用。联合应用HSV-tk/GCV系统与ATRA增强了对胶质瘤C6细胞的杀伤作用。