论文部分内容阅读
本论文的工作主要是研究HIV-1包膜蛋白gp160与其主要抗原决定簇的免疫原性。将gp160全长基因env的三段主要抗原表位连成嵌合基因构建到原核表达载体pRSETB上在大肠杆菌中进行表达，同时构建表达全基因env，利用亲和层析的方法对所表达的蛋白进行纯化，蛋白印迹和酶联免疫吸附方法分析其抗原性。
由于env基因所表达的产物对原核系统产生较大的毒性，并且env基因使用了较多的稀有密码子，在BL21(star)中未能表达。嵌合的三段抗原在BL21(star)中获得了高效表达，目的蛋白主要以包涵体的形式存在，经2M尿素洗涤又经Ni亲和树脂纯化。以纯化的融合蛋白片段为抗原检测中国生物制品检定所的40份来自全国各地的艾滋病参比血清，阳性检出率为100％、阴性检出率为85％，说明我们的抗原蛋白在阳性检测上可信度很高，但还存在不足之处，仍需改进。
为了能与真核系统表达的糖基化蛋白在抗原性上作一个比较，选用毕赤酵母表达系统为糖基化蛋白表达的代表，将gp160的全长基因env及其嵌合抗原基因分别构建到酵母分泌表达载体pPICZαB上，目前这步工作已基本完成，全长基因已在毕赤酵母GS115中尝试表达，嵌合抗原正在表达之中。
自从发现了人类免疫缺陷病毒(HIV)以来，人们就一直在想办法检测HIV。早期的诊断，主要是通过血清学试验检测抗HIV的抗体，间接地诊断HIV感染。至今为止，血清学试验依然是HIV实验室诊断的主要依据。酶联免疫反应(即ELISA)方法判断HIV感染，至今已发展了四代，不仅灵敏度和特异性大大提高，而且诊断时间也大大缩短了。鉴于目前艾滋病检测试剂盒主要是从国外进口，且成本较高，在检测中假阳性率较高。为适应本国的流行毒株检测的需要，减少艾滋病人确诊成本，我们试图用基因工程的方法表达HIV-1包膜蛋白及其重要抗原，得到一种能对HIV各种亚型都适用的抗原，建立适合国内需要的艾滋病诊断方法和技术，为我国艾滋病的诊断和预防打下基础。
血清中抗HIV抗体是判断HIV感染的间接指标。研究表明，绝大多数HIV感染者体内产生的抗体，主要是针对包膜糖蛋白前体(HIV-1gp160)及其后加工产物一外膜糖蛋白(HIV-1gp120)和跨膜糖蛋白(HIV-1gp41)，而且可以维持终生。因此表达全长的HIV膜蛋白，可极好的用于艾滋病的检测与诊断，但是由于膜蛋白表达相对较困难，我们的方案是选择表达膜蛋白上重要的抗原活性区，并比较二者在抗原性上的差异。为了发展一种可信度高且便宜的血清学诊断方法，我们通过计算机软件对env蛋白的疏水性组成、潜在的抗原表位及各亚型氨基酸序列保守性进行分析，并结合已有的实验支持，选择了三段保守性较强的重要抗原表位构建成嵌合抗原，分别在大肠杆菌和毕赤酵母系统中进行重组质粒的构建、表达，并对表达产物进行免疫原性的分析及比较。
本论文的实验部分主要集中在两个方面：(1)在大肠杆菌体系中构建了表达全env蛋白的重组质粒pRSETB-env，但未检测到env全长蛋白的表达，原因初步推断为env蛋白对大肠杆菌的毒性较大及所用的稀有密码子较多，不适合在此体系中表达；(2)在大肠杆菌表达体系构建出了涵盖三个重要抗原表位的重组质粒pRSETB-123，三段抗原表位分别位于env蛋白的469-511aa(位于gp120的C4区，保守区，变异率小，可检测)、538-674aa(包括gp120和gp41的交界区及gp41上的重要抗原活性区，能识别几乎所有的HIV-1感染者血清)、700-734aa(根据该段序列合成的多肽可特异性识别gp160)，目的蛋白主要以包涵体的形式存在，经尿素处理亲和层析纯化后，westernblot结果显示该蛋白具有很好的免疫原性；用该抗原蛋白包被免疫平皿，ELISA方法对中国药品检定所提供的全国各地的40多份艾滋病病人血清进行鉴定，结果显示我们所表达的嵌合抗原具有较好特异性，检测阳性血清准确率为100％，揭示其可用于感染诊断的良好前景，但仍存在不足之处，如阴性样品中出现假阳性，可能是因为我们的蛋白纯度不够造成的，在样品纯化方法上还应继续摸索。
此外，我们选取了毕赤酵母系统表达上述的env全蛋白和三段重要抗原区的蛋白，因为env蛋白都属于糖蛋白，真核表达体系可以对蛋白进行更好的糖基化修饰从而具有更高的生物活性，同时还可以与原核表达体系进行比较表达蛋白的差别。分别构建表达的重组克隆pPICZαB-env和pPICZαB-123，前者已在毕赤酵母中尝试表达，westernblot结果不甚理想，具体表达条件还有待探索。
本论文利用原核表达体系制备的嵌合抗原有望用于我国艾滋病的检测与诊断；env全蛋白在原核、真核体系中均未获得良好的表达，具体原因有待进一步的研究。通过论文整个工作，对env蛋白及其嵌合抗原的制备建立了初步的平台，为以后开发建立我国艾滋病检测与诊断的方法奠定了基础。