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纤维素酶随机水解纤维素主链的β-1,4-糖昔键,广泛应用在工业生产领域,同木聚糖酶联合使用可以用来转化环境友好燃料-乙醇,利用自然界的可再生资源：纤维素和半纤维素。然而工业生产条件往往比较苛刻,使得纤维素酶的利用受到很大限制。除了筛选合适菌种外,人们希望利用蛋白质工程手段改造纤维素酶性质。这就需要了解蛋白质序列同蛋白质功能和空间结构的相关知识。本文用计算机分子模拟方法对纤维素酶进行了家族分析和分子改造设计。
首先,从Swiss-prot蛋白质数据库中收集家族5纤维素酶蛋白质序列,从相关文献中查找每一条纤维素酶序列的最适温度和最适pH值,挖掘具有耐碱特性和耐高温特性的极端纤维素酶。同时,从PDB蛋白质结构数据库中收集已经测得晶体结构的纤维素酶。对家族5的49个纤维素酶建立进化树,进行亚家族分类,以每个亚家族中结构功能较清楚的酶为参照对象分析亚家族内的酶,得出与温度适应性和pH适应性有关的结构特征,将这些特征作为后面分子改造的理论依据。
然后,通过对Humicola inslens EGV和与它同源的耐热酶进行序列结构的分析,比较环区、二硫键、氢键、离子键、疏水作用、二级结构稳定性等差异,结合以上总结的耐热酶结构特征确定了改造EGV耐热性的定点突变体。
最后,通过计算机模拟技术模拟突变体,分析二级结构稳定性、二硫键、离子键、疏水作用、溶剂可及性、底物作用等变化综合各项评分筛选出构象最合理的突变体进行下一步的实验操作。
本文利用家族同源分析挖掘极端特性纤维素酶的序列结构特征,归纳出对热稳定性、pH稳定性有利的氨基酸位点和特殊结构,为新型工业纤维素酶以及其他工业酶的理性设计提供了理论基础。利用计算机辅助设计为突变体的理性设计提供了详细的结构基础。利用计算机模拟、结构能量合理性评估软件预测突变体结构功能变化影响,筛选出最合理的突变体,大大减少了实验和后期筛选的工作量。体现出生物技术与计算机技术的完美结合。