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研究背景与目的：
帕金森病病理学特征表现为患者大脑黑质多巴胺能神经元变性死亡。其发生受多种因素影响，包括遗传、环境和年龄。黑质区神经元的异常减少被证实受复杂机制调控，凋亡、自噬、氧化应激、线粒体功能障碍、神经炎等均与神经元的异常减少有关。但引起黑质多巴胺能神经元变性死亡的病因及机制尚未完全明了，研究其发病机制、寻求新的治疗方法仍旧是一个亟待解决的问题。
长链非编码RNA(Long non-coding RNAs，LncRNAs)是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA序列。在SH-SY5Y细胞中，过表达lncRNAsmallnucleolarRNAhostgene1(SNHG1)能够通过抑制miR-15b-5p，激活SIAH1，从而促进细胞内α-synuclein聚集，诱导细胞毒性。但是SNHG1在帕金森病细胞模型中的功能及机制仍旧不清楚。
本课题通过建立帕金森病细胞模型，探讨SNHG1在1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methy1-4-phenylpyridinium，MPP+)诱导的SH-SY5Y神经元凋亡及氧化应激反应中的作用及机制。
第一部分lncRNASNHG1、miR-15b-5p及GSK3β在MPP+诱导的帕金森病细胞模型中的表达
目的：
探索lncRNASNHG1、miR-15b-5p及GSK3β在MPP+诱导的帕金森病细胞模型中表达的变化。
方法：
1.MPP+诱导SH-SY5Y神经元建立帕金森病细胞模型。
2.免疫荧光实验标记酪氨酸羟化酶鉴定SH-SY5Y神经元分化。
3.逆转录-定量聚合酶链式反应(Reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)检测SNHG1、miR-15b-5p及GSK3β的基因表达。
4.蛋白质印记技术(Western blot，WB)检测GSK3β的蛋白表达。
结果：
1.视黄酸诱导组细胞绿色荧光强度高于未诱导组。
2.不同剂量MPP+诱导SH-SY5Y神经元。SNHG1和GSK3β表达水平随MPP+剂量增加而增加(P＜0.05)，miR-15b-5p表达水平随MPP+剂量增加而降低(P＜0.05)。
3.SNHG1和GSK3β表达水平随MPP+诱导时间增加而增加，miR-15b-5p表达水平随MPP+诱导时间增加而降低。
结论：
MPP+诱导能够促进SH-SY5Y神经元内SNHG1和GSK3β表达，但抑制miR-15b-5p表达。
第二部分lncRNASNHG1在MPP+诱导的神经元凋亡及氧化应激中的作用
目的：
明确SNHG1在MPP+诱导的SH-SY5Y神经元凋亡及氧化应激反应中的作用。
方法：
利用pcDNA-SNHG1和si-SNHG1调控SNHG1表达，CCK-8检测细胞活性，TdT-mediateddUTPNick-Endlabeling(TUNEL)检测凋亡、2?,7?-二氯二氢荧光素二乙酸脂(2?,7?-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)荧光探针检测ROS。
结果：
1.pcDNA-SNHG1和si-SNHG1不影响细胞活性。
2.细胞活性随MPP+剂量增加而降低(P＜0.01)。
3.与pcDNA组相比，pcDNA-SNHG1组SNHG1表达水平显著升高。与si-NC组相比(P＜0.001)，si-SNHG1组SNHG1表达水平显著降低(P＜0.001)。
4.过表达SNHG1促进MPP+诱导的细胞活性下降(P＜0.01)，沉默SNHG1抑制MPP+诱导的细胞活性下降(P＜0.01)。
5.过表达SNHG1促进MPP+诱导的细胞凋亡(P＜0.05)，沉默SNHG1抑制MPP+诱导的细胞凋亡(P＜0.01)。
6.过表达SNHG1促进MPP+诱导的氧化应激反应(P＜0.05)，沉默SNHG1抑制MPP+诱导的氧化应激反应(P＜0.01)。
7.过表达SNHG1促进细胞凋亡相关蛋白Cyt-C、cleaved-caspase3表达。沉默SNHG1抑制Cyt-C、cleaved-caspase3表达。
结论：
MPP+诱导SH-SY5Y神经元凋亡及氧化应激，上调SNHG1促进MPP+诱导的细胞损伤，而沉默SNHG1抑制MPP+诱导的细胞损伤。
第三部分lncRNASNHG1在帕金森病细胞模型中的作用机制
目的：
明确SNHG1与miR-15b-5p之间的靶标关系。阐明GSK3β是否作为miR-15b-5p的靶基因。
方法：
荧光素酶报告基因系统验证SNHG1和miR-15b-5p靶向关系，GSK3β是miR-15b-5p靶基因。
结果：
1.与miR-NC+SNHG1-WT组相比，miR-15b-5p+SNHG1-WT组细胞荧光素酶活性显著下降(P＜0.001)。与anta-NC+SNHG1-WT组相比，anta-miR-15b-5p+SNHG1-WT组细胞荧光素酶活性显著升高(P＜0.001)。转染SNHG1-MUT各组细胞之间荧光素酶活性没有差异。
2.与pcDNA组相比，pcDNA-SNHG1组miR-15b-5p表达水平显著降低(P＜0.001)。与si-NC组相比，si-SNHG1组miR-15b-5p表达水平显著升高(P＜0.001)。
3.MPP+(1 mM )诱导SH-SY5Y细胞24h后，转染miR-15b-5p组细胞活性显著高于miR-NC组(P＜0.001)，而转染miR-15b-5p+pcDNA-SNHG1组细胞活性显著低于miR-15b-5p组(P＜0.01)。此外，与anta-NC组相比，转染anta-miR-15b-5p组细胞活性显著降低(P＜0.05)，且与anta-miR-15b-5p组相比，anta-miR-15b-5p+si-SNHG1组细胞活性显著升高(P＜0.05)。
4.MPP+(1 mM )诱导SH-SY5Y细胞24h后，转染miR-15b-5p组细胞凋亡水平显著低于miR-NC组(P＜0.01)，而转染miR-15b-5p+pcDNA-SNHG1组细胞凋亡水平显著高于miR-15b-5p组(P＜0.05)。此外，与anta-NC组相比，转染anta-miR-15b-5p组细胞凋亡水平显著升高(P＜0.05)，且与anta-miR-15b-5p组相比，anta-miR-15b-5p+si-SNHG1组细胞凋亡水平显著降低(P＜0.05)。
5.MPP+(1 mM )诱导SH-SY5Y细胞24h后，转染miR-15b-5p组细胞内ROS水平显著低于miR-NC组(P＜0.01)，而转染miR-15b-5p+pcDNA-SNHG1组细胞内ROS水平显著高于miR-15b-5p组(P＜0.01)。此外，与anta-NC组相比，转染anta-miR-15b-5p组细胞内ROS水平显著升高(P＜0.05)，且与anta-miR-15b-5p组相比，anta-miR-15b-5p+si-SNHG1组细胞内ROS水平显著降低(P＜0.05)。
6.MPP+(1 mM )诱导SH-SY5Y细胞24h后，miR-15b-5p组Cyt-C、cleaved-caspase3表达水平显著低于miR-NC组，miR-15b-5p+pcDNA-SNHG1组Cyt-C、cleaved-caspase3表达水平显著高于miR-15b-5p组。此外，与anta-NC组相比，anta-miR-15b-5p组Cyt-C、cleaved-caspase3表达水平显著升高，且与anta-miR-15b-5p组相比，anta-miR-15b-5p+si-SNHG1组Cyt-C、cleaved-caspase3表达水平显著降低。
7.与miR-NC+WT-GSK3β-3-UTR组相比，miR-15b-5p+WT-GSK3β-3-UTR组细胞荧光素酶活性显著降低(P＜0.001)。与anta-NC+WT-GSK3β-3-UTR组相比，anta-miR-15b-5p+WT-GSK3β-3-UTR组细胞荧光素酶活性显著升高(P＜0.01)。转染WUT-GSK3β-3-UTR的各组细胞之间荧光素酶活性无显著差异。
8.与miR-NC组相比，miR-15b-5p组GSK3βmRNA与蛋白表达水平均显著降低(P＜0.001)。与anta-NC组相比，anta-miR-15b-5p组GSK3βmRNA与蛋白表达水平均显著升高(P＜0.001)。
9.MPP+(1 mM )处理SH-SY5Y细胞24h后，转染si-SNHG1+pcDNA-GSK3β组细胞活性显著低于si-SNHG1组(P＜0.05)。转染miR-15b-5p+pcDNA-GSK3β组细胞活性显著低于miR-15b-5p组(P＜0.05)。
10.MPP+(1 mM )处理SH-SY5Y细胞24h后，转染si-SNHG1+pcDNA-GSK3β组细胞凋亡水平显著高于si-SNHG1组(P＜0.05)。转染miR-15b-5p+pcDNA-GSK3β组细胞凋亡水平显著高于miR-15b-5p组(P＜0.05)。
11.MPP+(1 mM )处理SH-SY5Y细胞24h后，转染si-SNHG1+pcDNA-GSK3β组细胞内ROS产量显著高于si-SNHG1组(P＜0.05)。转染miR-15b-5p+pcDNA-GSK3β组细胞内ROS产量显著高于miR-15b-5p组(P＜0.05)。
12.MPP+(1 mM )处理SH-SY5Y细胞24h后，转染si-SNHG1+pcDNA-GSK3β组细胞内Cyt-C、cleaved-caspase3表达水平显著高于si-SNHG1组。转染miR-15b-5p+pcDNA-GSK3β组细胞内Cyt-C、cleaved-caspase3表达水平显著高于miR-15b-5p组。
结论：
1.SNHG1与miR-15b-5p靶向结合并抑制其表达。
2.SNHG1通过抑制miR-15b-5p促进MPP+诱导的SH-SY5Y神经元凋亡及氧化应激反应。
3.miR-15b-5p靶向结合GSK3β3-UTR区域并抑制其表达。
4.下调SNHG1能够通过miR-15b-5p/GSK3β信号途径抑制MPP+诱导的细胞凋亡及氧化应激反应。
5.SNHG1通过与GSK3β竞争性结合miR-15b-5p，促进GSK3β表达，从而促进MPP+诱导的细胞损伤。
帕金森病病理学特征表现为患者大脑黑质多巴胺能神经元变性死亡。其发生受多种因素影响，包括遗传、环境和年龄。黑质区神经元的异常减少被证实受复杂机制调控，凋亡、自噬、氧化应激、线粒体功能障碍、神经炎等均与神经元的异常减少有关。但引起黑质多巴胺能神经元变性死亡的病因及机制尚未完全明了，研究其发病机制、寻求新的治疗方法仍旧是一个亟待解决的问题。
长链非编码RNA(Long non-coding RNAs，LncRNAs)是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA序列。在SH-SY5Y细胞中，过表达lncRNAsmallnucleolarRNAhostgene1(SNHG1)能够通过抑制miR-15b-5p，激活SIAH1，从而促进细胞内α-synuclein聚集，诱导细胞毒性。但是SNHG1在帕金森病细胞模型中的功能及机制仍旧不清楚。
本课题通过建立帕金森病细胞模型，探讨SNHG1在1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methy1-4-phenylpyridinium，MPP+)诱导的SH-SY5Y神经元凋亡及氧化应激反应中的作用及机制。
第一部分lncRNASNHG1、miR-15b-5p及GSK3β在MPP+诱导的帕金森病细胞模型中的表达
目的：
探索lncRNASNHG1、miR-15b-5p及GSK3β在MPP+诱导的帕金森病细胞模型中表达的变化。
方法：
1.MPP+诱导SH-SY5Y神经元建立帕金森病细胞模型。
2.免疫荧光实验标记酪氨酸羟化酶鉴定SH-SY5Y神经元分化。
3.逆转录-定量聚合酶链式反应(Reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)检测SNHG1、miR-15b-5p及GSK3β的基因表达。
4.蛋白质印记技术(Western blot，WB)检测GSK3β的蛋白表达。
结果：
1.视黄酸诱导组细胞绿色荧光强度高于未诱导组。
2.不同剂量MPP+诱导SH-SY5Y神经元。SNHG1和GSK3β表达水平随MPP+剂量增加而增加(P＜0.05)，miR-15b-5p表达水平随MPP+剂量增加而降低(P＜0.05)。
3.SNHG1和GSK3β表达水平随MPP+诱导时间增加而增加，miR-15b-5p表达水平随MPP+诱导时间增加而降低。
结论：
MPP+诱导能够促进SH-SY5Y神经元内SNHG1和GSK3β表达，但抑制miR-15b-5p表达。
第二部分lncRNASNHG1在MPP+诱导的神经元凋亡及氧化应激中的作用
目的：
明确SNHG1在MPP+诱导的SH-SY5Y神经元凋亡及氧化应激反应中的作用。
方法：
利用pcDNA-SNHG1和si-SNHG1调控SNHG1表达，CCK-8检测细胞活性，TdT-mediateddUTPNick-Endlabeling(TUNEL)检测凋亡、2?,7?-二氯二氢荧光素二乙酸脂(2?,7?-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)荧光探针检测ROS。
结果：
1.pcDNA-SNHG1和si-SNHG1不影响细胞活性。
2.细胞活性随MPP+剂量增加而降低(P＜0.01)。
3.与pcDNA组相比，pcDNA-SNHG1组SNHG1表达水平显著升高。与si-NC组相比(P＜0.001)，si-SNHG1组SNHG1表达水平显著降低(P＜0.001)。
4.过表达SNHG1促进MPP+诱导的细胞活性下降(P＜0.01)，沉默SNHG1抑制MPP+诱导的细胞活性下降(P＜0.01)。
5.过表达SNHG1促进MPP+诱导的细胞凋亡(P＜0.05)，沉默SNHG1抑制MPP+诱导的细胞凋亡(P＜0.01)。
6.过表达SNHG1促进MPP+诱导的氧化应激反应(P＜0.05)，沉默SNHG1抑制MPP+诱导的氧化应激反应(P＜0.01)。
7.过表达SNHG1促进细胞凋亡相关蛋白Cyt-C、cleaved-caspase3表达。沉默SNHG1抑制Cyt-C、cleaved-caspase3表达。
结论：
MPP+诱导SH-SY5Y神经元凋亡及氧化应激，上调SNHG1促进MPP+诱导的细胞损伤，而沉默SNHG1抑制MPP+诱导的细胞损伤。
第三部分lncRNASNHG1在帕金森病细胞模型中的作用机制
目的：
明确SNHG1与miR-15b-5p之间的靶标关系。阐明GSK3β是否作为miR-15b-5p的靶基因。
方法：
荧光素酶报告基因系统验证SNHG1和miR-15b-5p靶向关系，GSK3β是miR-15b-5p靶基因。
结果：
1.与miR-NC+SNHG1-WT组相比，miR-15b-5p+SNHG1-WT组细胞荧光素酶活性显著下降(P＜0.001)。与anta-NC+SNHG1-WT组相比，anta-miR-15b-5p+SNHG1-WT组细胞荧光素酶活性显著升高(P＜0.001)。转染SNHG1-MUT各组细胞之间荧光素酶活性没有差异。
2.与pcDNA组相比，pcDNA-SNHG1组miR-15b-5p表达水平显著降低(P＜0.001)。与si-NC组相比，si-SNHG1组miR-15b-5p表达水平显著升高(P＜0.001)。
3.MPP+(1 mM )诱导SH-SY5Y细胞24h后，转染miR-15b-5p组细胞活性显著高于miR-NC组(P＜0.001)，而转染miR-15b-5p+pcDNA-SNHG1组细胞活性显著低于miR-15b-5p组(P＜0.01)。此外，与anta-NC组相比，转染anta-miR-15b-5p组细胞活性显著降低(P＜0.05)，且与anta-miR-15b-5p组相比，anta-miR-15b-5p+si-SNHG1组细胞活性显著升高(P＜0.05)。
4.MPP+(1 mM )诱导SH-SY5Y细胞24h后，转染miR-15b-5p组细胞凋亡水平显著低于miR-NC组(P＜0.01)，而转染miR-15b-5p+pcDNA-SNHG1组细胞凋亡水平显著高于miR-15b-5p组(P＜0.05)。此外，与anta-NC组相比，转染anta-miR-15b-5p组细胞凋亡水平显著升高(P＜0.05)，且与anta-miR-15b-5p组相比，anta-miR-15b-5p+si-SNHG1组细胞凋亡水平显著降低(P＜0.05)。
5.MPP+(1 mM )诱导SH-SY5Y细胞24h后，转染miR-15b-5p组细胞内ROS水平显著低于miR-NC组(P＜0.01)，而转染miR-15b-5p+pcDNA-SNHG1组细胞内ROS水平显著高于miR-15b-5p组(P＜0.01)。此外，与anta-NC组相比，转染anta-miR-15b-5p组细胞内ROS水平显著升高(P＜0.05)，且与anta-miR-15b-5p组相比，anta-miR-15b-5p+si-SNHG1组细胞内ROS水平显著降低(P＜0.05)。
6.MPP+(1 mM )诱导SH-SY5Y细胞24h后，miR-15b-5p组Cyt-C、cleaved-caspase3表达水平显著低于miR-NC组，miR-15b-5p+pcDNA-SNHG1组Cyt-C、cleaved-caspase3表达水平显著高于miR-15b-5p组。此外，与anta-NC组相比，anta-miR-15b-5p组Cyt-C、cleaved-caspase3表达水平显著升高，且与anta-miR-15b-5p组相比，anta-miR-15b-5p+si-SNHG1组Cyt-C、cleaved-caspase3表达水平显著降低。
7.与miR-NC+WT-GSK3β-3-UTR组相比，miR-15b-5p+WT-GSK3β-3-UTR组细胞荧光素酶活性显著降低(P＜0.001)。与anta-NC+WT-GSK3β-3-UTR组相比，anta-miR-15b-5p+WT-GSK3β-3-UTR组细胞荧光素酶活性显著升高(P＜0.01)。转染WUT-GSK3β-3-UTR的各组细胞之间荧光素酶活性无显著差异。
8.与miR-NC组相比，miR-15b-5p组GSK3βmRNA与蛋白表达水平均显著降低(P＜0.001)。与anta-NC组相比，anta-miR-15b-5p组GSK3βmRNA与蛋白表达水平均显著升高(P＜0.001)。
9.MPP+(1 mM )处理SH-SY5Y细胞24h后，转染si-SNHG1+pcDNA-GSK3β组细胞活性显著低于si-SNHG1组(P＜0.05)。转染miR-15b-5p+pcDNA-GSK3β组细胞活性显著低于miR-15b-5p组(P＜0.05)。
10.MPP+(1 mM )处理SH-SY5Y细胞24h后，转染si-SNHG1+pcDNA-GSK3β组细胞凋亡水平显著高于si-SNHG1组(P＜0.05)。转染miR-15b-5p+pcDNA-GSK3β组细胞凋亡水平显著高于miR-15b-5p组(P＜0.05)。
11.MPP+(1 mM )处理SH-SY5Y细胞24h后，转染si-SNHG1+pcDNA-GSK3β组细胞内ROS产量显著高于si-SNHG1组(P＜0.05)。转染miR-15b-5p+pcDNA-GSK3β组细胞内ROS产量显著高于miR-15b-5p组(P＜0.05)。
12.MPP+(1 mM )处理SH-SY5Y细胞24h后，转染si-SNHG1+pcDNA-GSK3β组细胞内Cyt-C、cleaved-caspase3表达水平显著高于si-SNHG1组。转染miR-15b-5p+pcDNA-GSK3β组细胞内Cyt-C、cleaved-caspase3表达水平显著高于miR-15b-5p组。
结论：
1.SNHG1与miR-15b-5p靶向结合并抑制其表达。
2.SNHG1通过抑制miR-15b-5p促进MPP+诱导的SH-SY5Y神经元凋亡及氧化应激反应。
3.miR-15b-5p靶向结合GSK3β3-UTR区域并抑制其表达。
4.下调SNHG1能够通过miR-15b-5p/GSK3β信号途径抑制MPP+诱导的细胞凋亡及氧化应激反应。
5.SNHG1通过与GSK3β竞争性结合miR-15b-5p，促进GSK3β表达，从而促进MPP+诱导的细胞损伤。