不同产地中药泽泻差异性三萜类成分的定性和定量分析

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中药泽泻为泽泻科植物泽泻Alisma orientale(Sam.)Juzep.的干燥块茎,是临床一种常用中药,具有利水渗湿等传统应用。泽泻主要化学成分为三萜类、倍半萜类及二萜类化合物,其中三萜是泽泻中最主要的小分子活性物质。现代研究表明,泽泻三萜类化合物具有降血脂、降血糖、抗炎等多方面活性。目前,市场上泽泻主要产地为四川、福建建瓯和江西广昌,分别称为川泽泻、建泽泻和江泽泻,三者在市场流通中均占有一定比例,其中“建泽泻”已获得GAP认证。然而,市场流通中常出现以川泽泻冒充建泽泻出售的现象,而《中国药典》中现行质量标准难以区分不同产地泽泻的优劣。  针对上述问题,本论文基于超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱(UPLC-QTOF-MS)和超高效液相色谱-四级杆离子阱质谱(UPLC-QTrap-MS)技术对三个主产地泽泻进行定性和定量分析,以评价不同产地泽泻在三萜类成分含量物质基础的差异,为泽泻的安全和质量可控提供更多研究依据。本论文主要包括以下三个方面内容:1)基于超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱(UPLC-QTOF-MS)对三个产地泽泻的三萜成分进行定性分析,采用非靶向植物代谢组学方法找到不同产地的差异性成分;2)对泽泻三萜类差异性成分进行靶向分离及鉴定;3)基于超高效液相色谱-四级杆离子阱质谱(UHPLC-QTrap-MS)对泽泻三萜类差异性成分进行含量测定。  首先,本论文建立了基于UPLC-QTOF-MS的定性分析方法,用来分析来自三个产地的32批泽泻,并采用组学分析方法找出其中的差异性成分。首先,数据采集,使用XB C18色谱柱,分析时间为45分钟,采集32批泽泻样品及其混合QC样品MSE数据;其次,数据处理,将其导入Progenesis QI软件进行峰对齐、离子融合和解卷积等处理,获得包含离子质荷比、保留时间、信号强度等相应信息的特征列表;最后,数据分析,将该列表导入SIMCA-P软件进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)等多元统计分析,以变量重要性投影(variable importance in the projection,VIP)值大于2.0为闽值,发现了23个差异性三萜类成分的化学标志物。  为鉴定差异性三萜类成分,对其进行靶向分离,共得到9个三萜类化合物。提取方法采用加热回流,取二氯甲烷萃取部位,结合硅胶色谱柱和制备液相色谱对目标成分分离富集。采用LC-MS分析跟踪目标成分,使用半制备液相色谱(Prep-HPLC)对目标成分进行纯化,利用高分辨质谱及一维和二维核磁共振手段对得到的单体化合物进行结构表征。最终得到9个化合物,包含1个新化合物和8个已知化合物。  最后,建立了基于UHPLC-QTrap-MS多反应监测MRM技术的含量测定方法,共测定了6个差异性三萜类成分和2个其他三萜类成分在32批泽泻中的含量。方法学考察结果表明,该方法专属性好,日内、日间精密度RSD为1.54%-6.91%,稳定性RSD为1.72%-4.47%,重复性RSD为2.7%-6.2%,回收率为89.4%-111.6%;使用统计方法验证8个三萜的标准曲线线性良好,最低检测限为0.0001-0.00714ng,最低定量限为0.00027-0.02703ng。含量测定结果表明,16-oxo-11-anhydroalisol A,alisol B23-acetate,alisol G alisol F24-acetate,alisol A和alisol A24-acetate含量在三个产地泽泻中具有统计学意义上的显著差异。  本研究通过对三个产地泽泻差异性三萜类成分进行分析与分离建立了泽泻的定性、定量研究方法,并对32批样品进行了评价,为泽泻安全、有效和质量可控研究奠定了基础。
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