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短散在重复序列(SINEs)和长散在重复序列(LINEs),是两类重要的反转座子,它们活跃增值于真核生物基因组中,是研究系统发育和群体遗传学的非常有用的分子标记。本研究中,我们设计了一种利用磁珠分选系统用于快速高效捕获基因组中的散在重复序列的实验方案和流程,代替目前该领域传统的通过构建基因组文库再进行southern杂交扫描的实验方案。在这个流程中,探针被绑定到磁珠上形成单链探针复合物,然后在溶液中钓取酶切后的目的基因组片段。利用该方法,我们从鲢和鳙中分离得到了一个新的SINE家族,命名为HAmo SINE它具有典型的SINE的结构特征,成员之间序列差异非常小,每个成员两端都有明显的正向重复序列,这些证据表明HAmoSINE是一个年轻的SINE家族。荧光定量估计鲢和鳙基因组中HAmoSINE的拷贝数为2×105和1.7×105。同时,我们分离得到了HAmoSINE反转座寄生的LINE家族-HAmoLINE2,它们具有相同的尾部序列和二级结构,这表明HAmoSINE通过其与尾部序列借用HAmoLINE编码的反转录酶来实现自身近期在鲢和鳙荩因组中不断增殖。通过序列的比对和SINE结构分析,发现HAmoSINE,SmaI SINE和FokI SINE是三个高度相似但却是在各自进化潜系中独立进化产生的,而它们寄生的LINE2家族却是同一起源的。鲢和鳙基因组中的年轻的HtAmoSINE家族和HAmoLINE反转座寄生关系为如下已经建立的机制和学说提供了很好的数据支撑:反转录起始的滑动机制,SINE反转座寄生于LINE学说,SINE和LINE尾部茎环二级结构,SINE起源时的模板互换机制。
我们进一步分析了HAmoSINE和HAmoLINE在整个鲤科鱼类代表物种基因组中的进化模式。通过磁珠分选技术和内部引物PCR的方法,我们在17种鲤科鱼类代表物种中分离得到了67个HAmoSINE全长和125个HAmoSINE部分序列以及17个HAmoLINE序列。根据特征性的诊断性核苷酸的存在,发现四个HAmoSINE源基因(亚家族)活跃增殖于整个鲤科鱼类或特定谱系中,HAmoSINE在这些鱼类中的拷贝数从104到106不等。在斑马鱼中,我们确认了HAmoSINE typeⅣ亚家族的105个成员,但是没有发现HAmo SINE typeⅠ,Ⅱ,Ⅲ亚家族的存在。HAmoSINE物种分布范围研究表明,HAmoSINE在鲤形目的胭脂鱼科,双孔鱼科,鳅科,平鳍鳅科的代表物种中存在,但是在测试的鲶形目,多鳍鱼目,雀鳝目,鲟形目等代表物种中没有发现其存在。
在鲀科鱼类中,我们通过比较分析红鳍东方纯和黑青斑河纯两个全基因组内部所有SINE同源位点,分离那些红鳍东方纯基因组内特异的SINE位点(相对于黑青斑河鲀科),然后选取部分特异SINE位点在整个鲀科鱼类中来研究它们的进化模式。另外基于两个线粒体基因(Cytb and ND4)数据运用分区的最大似然法和贝叶斯方法构建了整个鲍科鱼类的系统发育关系。系统发育关系显示,整个鲀科鱼类分成三个高度支持的枝:CladeⅠ,Ⅱ,Ⅲ。我们通过实验验证了20个红鳍东方鲀基因组中特异的SINE位点(相对于黑青斑河纯),发现6个特异性的捅入到CladeⅠ(东方鲀属+宽吻鲀属+头丽纹鲀属)的所有物种中。这个结果支持CladeⅠ节点的分歧时间估计和东方鲀属的爆炸式物种形成模式。