【摘 要】
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本论文对Hevein基因进行了克隆、序列分析,并对其进行了体外表达和植物遗传转化研究.从橡胶树胶乳中分离提取出总RNA,根据文献报道的编码Hevein的cDNA序列设计合成DNA引物,用
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本论文对Hevein基因进行了克隆、序列分析,并对其进行了体外表达和植物遗传转化研究.从橡胶树胶乳中分离提取出总RNA,根据文献报道的编码Hevein的cDNA序列设计合成DNA引物,用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法扩增获得Hevein原基因,克隆进pGEM5Zf-T载体,序列分析表明所获得的基因片断和报导的Hevein cDNA序列同源性达92%,其中编码成熟Hevein肽的基因序列具有100%同源性.表明成熟Hevein具有相当大的保守性.用克隆基因做模板,通过PCR方法获得成熟Hevein基因的129bp的编码序列、定向插入pET22b<(+)>原核表达载体,转化E.coli BL21(DE<,3>)受体菌,用SDS-PAGE分离检测到4.7KD表达产物.在此基础上,构建了可在酵母中表达成熟Hevein以及Hevein融合蛋白的4个表达载体,为通过发酵大量制备Hevein基因产物打下基础.为了进一步证明Hevein基因的抗病作用,用定向克隆方法把带有起始密码子的成熟Hevein基因片断插入pBI121质粒,构建了植物表达载体pBIH,通过三亲交配导入农杆菌LBA4404,侵染蕃茄叶盘,经卡那霉素抗性选择培养,PCR鉴定得转基因蕃茄植株,拟进一步进行遗传定和抗病性分析.为了进一步明X.Gidrol等在"凝集素假说"中提出的Hevein做为凝固因子引发乳原位凝固,进而导死皮发生的假说,本文进行了Hevein反义基因转化橡树的研究.本文还在综述了橡胶树死皮病研究进展基础上,根据分子生物学研究最新成果提出了死皮病发生的新概念,指出"死皮病可由生物、生理多种因子胁迫引发,通过氧化跃变产生的信号分子转导,激发细胞程序性死亡机制发挥作用."
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