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目的:细胞周期依赖激酶（Cyclin Dependent Kinase,CDK）4/6抑制剂是特异性的细胞周期激酶4/6的抑制剂。细胞周期调控异常是恶性肿瘤的基本特征之一。探讨CDK4/6抑制剂哌柏西利在NSCLC细胞系中的作用以及KRAS突变、LKB1突和KRAS/LKB1共突变能否成为预测CDK4/6抑制剂疗效的生物标志物。探讨CDK4/6抑制剂能否逆转三代EGFR-TKI奥希替尼的耐药,CDK4/6抑制剂和奥希替尼是否具有协同作用,逆转耐药可能的机制,进而为CDK4/6抑制剂在非小细胞肺癌未来治疗中找到获益人群并提供合理的治疗策略。方法:应用CCK8（Cell Counting Kit 8）探索多种NSCLC细胞系对CDK4/6抑制剂哌柏西利的敏感性。用Western Blot检测LKB1是否敲降成功,探索KRAS突变、LKB1突变和KRAS/LKB1共突变是否和CDK4/6抑制剂哌柏西利的敏感性相关。用Western Blot、Real-Time PCR探索奥希替尼耐药细胞系H1975OR的耐药机制是否和细胞周期调控异常相关,评估细胞周期相关基因和蛋白如CDK4、CDK6、Cyclin D1、RB、CDKN2A以及EMT相关基因Snail等在敏感细胞系H1975S和耐药细胞系H1975OR之间是否存在差异;流式细胞仪检测H1975S和H1975OR在细胞周期分布方面是否存在差异。在药物应用方面,首先评估哌柏西利在H1975S和H1975OR敏感性是否存在差异;其次用药物协同指数评估,哌柏西利和奥希替尼是否存在协同和叠加效应;最后用Western Blot、Real-Time PCR评估单药哌柏西利、单药奥希替尼以及联合治疗细胞周期相关蛋白及Snail蛋白的变化,探讨CDK4/6抑制剂哌柏西利联合奥希替尼逆转三代EGFR-TKI耐药的机制。结果:（1）、Western Blot验证H1299-sh LKB1#408和H1299-sh LKB1#411细胞系,LKB1敲降成功,H1299-sh LKB1#407细胞系LKB1未敲降成功。进一步对多种肺癌细胞系进行CDK4/6抑制剂敏感性实验。在KRAS/LKB1野生型细胞系H1975、H1299细胞系,KRAS突变细胞系Calu-1,LKB1敲降细胞系H1299-sh LKB1#408、H1299-sh LKB1#411,LKB1未敲降成功细胞系H1299-sh LKB1#407以及LKB1/KRAS共突变细胞系A549和H460对CDK4/6抑制剂哌柏西利IC50分别为12.93μM、13.01μM、29.22μM、9.478μM、12.84μM、11.44μM、6.604μM和10.46μM。和H1975S细胞系相比,Cula-1对CDK4/6抑制剂敏感性降低（P=0.001）、A549敏感性增加（P=0.005）、H460细胞系敏感性没有统计学差异（P=0.140）。和H1299相比,H1299-sh LKB1#407、H1299-sh LKB1#408和H1299-sh LKB1#411细胞系哌柏西利IC50无统计学差异（P值分别为0.459,0.158和0.967）。整体上KRAS/LKB1共突变可能会导致对CDK4/6抑制剂敏感性增加,但是没有达到10倍以上的差异。（2）和H1975S细胞系相比,H1975OR耐药细胞系对CDK4/6抑制剂哌柏西利的敏感性增加,IC50分别为12.94μM和4.776μM,具有统计学差异（P<0.05）。在细胞周期方面,敏感细胞系H1975S G1期细胞占38.70%（±3.51%）,耐药细胞系H1975OR G1期细胞占25.5%（±1.15%）,具有统计学差异（P=0.023）。在H1975OR细胞系中,和DMSO相比,单用哌柏西利明显增加G1期阻滞细胞比例58.79%（±0.80%）,联合奥希替尼G1期阻滞细胞比例进一步增高71.33%（±3.55%）,具有统计学差异（P<0.001）。在H1975OR细胞系中,单用CDK4/6抑制剂哌柏西利（1.25μM）细胞存活率81.67%（±1.29%）,单用奥希替尼（2.5μM）细胞存活率为73.80%（±5.41%）,联合治疗细胞存活率为40.67%（±1.13%）,联合治疗和任何单药相比,均具有统计学差异（P<0.05）。在机制方面,和H1975S细胞系相比,H1975OR细胞系RT-PCR显示:促进细胞周期的相关基因CDK4、CDK6、CCND1 m RNA水平明显上调,分别增加敏感细胞的1.43倍、1.81倍和1.96倍（具体P值为0.065、0.052,0.049）,而抑制细胞周期的相关基因CDKN1A、CDKN1B、CDKN2A、CDKN2B m RNA明显下调,分别为敏感细胞的34.40%、15.63%、32.17%和24.95%（具体P值为0.041、0.0.12、0.003和0.001）。Western Blot证实CDK4、p-RB在耐药细胞系H1975OR中明显增强;H1975S细胞系,随着奥希替尼作用时间延长,CDK4、p-RB在增强,细胞周期异常参与耐药机制。CDK4/6抑制剂哌柏西利联合奥希替尼能够抑制CDK4/6-Cyclin D1的功能活化,抑制p-RB的初始磷酸化,下调p-RB磷酸化,进而阻滞细胞通过R限制点,进入细胞合成S期,控制肿瘤增殖。（3）在H1975OR细胞系中,Western Blot证实Snail中表达增强,但是RT-PCR Snail m RNA在敏感细胞H1975S和耐药细胞H1975OR无明显增加,没有统计学差异。进一步验证,Snail蛋白表达增加主要是由于调控Snail去泛素化酶DUB3增加,RT-PCR证实在耐药细胞H1975OR细胞系DUB3 m RNA明显增加。CDK4/6抑制剂可能调控DUB3基因的表达来调控Snail,参与逆转耐药。结论:KRAS突变、LKB1突变和KRAS/LKB1共突变不能作为单药CDK4/6抑制剂哌柏西利在NSCLC细胞系疗效相关的生物标记物。细胞周期调控异常参与三代EGFR-TKI奥希替尼耐药机制,CDK4/6抑制剂哌柏西利联合奥希替尼通过调控细胞周期、EMT等多种通路逆转耐药,有进一步在临床验证的研究价值。