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目的:研究非小细胞肺癌（NSCLC）奥希替尼获得性耐药细胞中,靶向DNA-PK联合Osimertinib克服奥希替尼耐药的效果及分子机制,为临床晚期NSCLC奥希替尼耐药后的治疗提供新的帮助。方法:本课题分成三个部分展开研究:1、选取具有EGFR L858R/T790M双突变的非小细胞肺癌H1975细胞系,Osimertinib从低浓度到高浓度持续诱导构建耐药细胞模型;二代测序检测亲本及耐药细胞株基因组变化差异,验证目前已知耐药机制及寻找耐药驱动基因。2、无明确耐药驱动基因的情况下,试图确定与Osimertinib具协同作用的化合物所揭示的靶点或通路。从文献提供的化合物库中,筛选到化合物PI103与Osimertinib具有协同作用。随后CCK8实验及Calcusyn软件检测PI103各靶点（m TOR、PI3K及DNA-PK）抑制剂与Osimertinib的联合作用效应,测得DNA-PK特异性抑制剂NU7441与Osimertinib联合作用能协同抑制耐药细胞增殖;结晶紫染色进一步检测联合用药对耐药细胞存活能力的影响;流式细胞周期检测联合作用对耐药细胞周期分布的影响;最后慢病毒质粒降表达DNA-PK,CCK8检测耐药细胞中DNA-PK降表达对Osimertinib敏感性的影响;3、DNA-PK是参与DNA损伤修复反应的关键激酶之一,且EGFR在DNA损伤修复中起着重要作用,随后检测Osimertinib长期诱导后,耐药细胞EGFR活性的抑制是否对DNA损伤修复造成影响,以及靶向DNA-PK是否有助于克服Osimertinib耐药。利用Cisplatin诱导DNA损伤,γH2AX水平评估DNA损伤程度,彗星实验评估DNA损伤及修复情况;首先Western Blot检测相同Cisplatin诱导下敏感及耐药细胞细胞γH2AX的水平差异;碱性彗星实验检测相同Cisplatin诱导及修复后耐药细胞彗星拖尾情况;随后Western Blot进一步检测DNA损伤诱导后敏感及耐药细胞p DNA-PK（S2056）的水平变化;最后Western Blot及碱性彗星实验进一步检测DNA-PK特异性抑制剂与Osimertinib分别单药及联合用药对DNA-PK活性及DNA彗星拖尾的影响。结果:1、奥希替尼耐药细胞模型（H1975-Osimertinib-Resistant,H1975-OR）构建后,CCK8检测亲本细胞（H1975-Osimertinib-Sensitive,H1975-S）的IC50值平均0.17μM,耐药细胞IC50值平均8.42μM,具有显著差异;细胞凋亡检测、结晶紫染色及Western Blot进一步证实Osimertinib获得性耐药细胞模型构建成功。二代测序未检出EGFR C797S、MET及HER2扩增、RAS突变等目前已知三代TKI耐药机制及明确新的耐药驱动基因。2、CCK8实验及联合作用定量评价软件（Calcusyn）提示,耐药细胞中化合物PI103与Osimertinib具有协同作用;随后相同实验方法检测出PI103的作用靶点中DNA-PK抑制剂与Osimertinib能协同抑制耐药细胞增殖;结晶紫染色进一步证实,DNA-PK抑制剂与Osimertinib联合作用能明显降低耐药细胞存活能力;细胞周期检测提示DNA-PK抑制剂与Osimertinib联合作用能增加耐药细胞G1期阻滞;最慢病降表达DNA-PK,耐药细胞对Osimertinib的敏感性增强。3、Western Blot显示,相同DNA损伤诱导下,耐药细胞γH2AX的水平较敏感细胞增高;碱性彗星实验表明,在相同DNA损伤诱导后,敏感及耐药细胞均出现了明显的彗星拖尾,且耐药细胞拖尾更长;撤药24小时后,敏感细胞的彗星拖尾明显缩短,而耐药细胞中依然能观察到高强度的彗星拖尾,提示耐药细胞中存在更广泛的DNA断裂和延迟的DNA损伤修复;随后,Western Blot进一步证实,相同DNA损伤诱导后,耐药细胞DNA-PK磷酸化水平较敏感细胞明显增高;最后,Western及碱性彗星实验进一步证实,DNA-PK抑制剂与Osimertinib联合作用能抑制DNA-PK磷酸化,且延长耐药细胞的彗星拖尾。结论:1、奥希替尼获得性耐药细胞模型（H1975-OR）构建成功,二代测序未发现目前已知耐药机制及明确的新的耐药驱动基因;2、靶向DNA-PK联合奥希替尼可促进细胞周期G1期阻滞,从而抑制细胞增殖;慢病毒质粒降表达DNA-PK可增强耐药细胞对Osimertinib的敏感性;3、与亲本细胞相比,奥希替尼耐药细胞的DNA修复能力下降;耐药细胞在DNA损伤应答中DNA-PK高度活化,提示耐药细胞的DNA修复可能高度依赖DNA-PK活性;靶向DNA-PK联合奥希替尼可协同抑制DNA-PK活性进而抑制DNA损伤修复,导致DNA损伤持续存在,进而促进细胞凋亡;