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草鱼出血病是我国养殖草鱼鱼种阶段最为严重的病毒性疾病，其病原为草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus, GCRV)。GCRV是我国分离鉴定的第一株鱼类病毒，其基因组由11条分节段的双链RNA分子组成。GCRV核衣壳蛋白VP6由其基因组第8片段（S8）编码，含有418个氨基酸、分子量约为46kD，三维重构结果显示其是病毒内核和外壳的连接蛋白，在病毒的转录、复制中发挥重要作用。对GCRV单个多肽的免疫原性研究证实VP6蛋白可以作为制备草鱼出血病疫苗的候选蛋白。 为实现GCRV VP6蛋白在毕赤酵母中的胞内表达，本研究首先探索了增强绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP）在毕赤酵母中的表达，随后构建了表达GCRV VP6蛋白的酵母表达载体pPICZB-VP6，并成功实现了VP6蛋白在毕赤酵母中的胞内表达，为后期研制草鱼出血病重组酵母口服疫苗奠定了基础。本论文主要内容如下： 1．根据GeneBank中pEGFP-C1载体的全基因序列（U55763）设计一对特异扩增引物，分别引入酶切位点EcoRⅠ、SacⅡ，以pEGFP-C1质粒为模板进行PCR扩增，将得到的大小约720bp的基因片段与 pCR2.1载体连接，转化大肠杆菌DH5α，经鉴定后克隆至毕赤酵母胞内表达载体 pPICZB，构建了重组酵母表达载体pPICZB-EGFP。重组质粒经SacⅠ线性化，电穿孔法将其整合到毕赤酵母KM71宿主菌。在Zeocin抗性平板上筛选转化子，提取基因组DNA进行PCR鉴定。选取阳性转化子在BMMY培养基中以30℃，0.5%的甲醇添加量，连续诱导4天。表达产物在荧光显微镜下能观察到明显的绿色荧光，表明成功表达了具有生物活性的EGFP蛋白；通过流式细胞仪分析，初步确定甲醇诱导3天时重组酵母的含量最高，占总酵母细胞的81.07%。 2．根据GeneBank中草鱼呼肠孤病毒104株VP6蛋白的全基因序列(HM234682)设计一对特异扩增引物，从感染草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的草鱼肾细胞(CIK)中提取病毒核酸作为模板，进行RT-PCR扩增，得到约1.3Kbp的VP6基因读码框片段，将扩增的VP6基因片段与pCR2.1载体连接，经酶切、PCR扩增和序列鉴定确认正确后，再将其克隆至毕赤酵母胞内表达载体 pPICZB，构建了重组酵母表达质粒pPICZB-VP6。重组质粒经SacⅠ线性化，电穿孔法将其整合到毕赤酵母KM71宿主菌，挑取转化子进行 PCR鉴定和测序分析。筛选高拷贝转化子，在30℃，0.5%甲醇添加量的条件下诱导3天，此时以pPICZB-EGFP/KM71重组酵母菌为条件对照。表达产物进行SDS-PAGE和Western blot检测，结果表明成功实现了GCRV VP6蛋白在毕赤酵母中的胞内表达，重组VP6蛋白分子量约46kDa，与天然VP6蛋白分子量接近，可与VP6多克隆抗体发生特异性反应。