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毕赤酵母已广泛应用于重组蛋白的表达,这主要得益于其高效的PAOX1,该启动子受甲醇的严格诱导,在其它碳源,如甘油、葡萄糖等碳源存在的情况下会被抑制。目前已对甘油或葡萄糖条件下,PAOX1的调控机制进行研究,发现调控PAOX1表达的激活性转录因子有Mxr1、Prm1和Mit1,抑制性的转录因子为Nrg1和Mig,并通过对这些转录因子进行改造获得了非甲醇依赖型的毕赤酵母表达系统。甲醇具有易燃易爆、有毒等特点,这限制了毕赤酵母在大规模发酵、食品和医药产品中的应用。毕赤酵母代谢甲醇时,需要消耗大量的能量合成醇氧化酶,其表达量占总可溶蛋白的30%。本研究通过对毕赤酵母中甲醇代谢途径相关调控基因的改造,获得非甲醇利用型的高产重组蛋白菌株,并通过转录组学方法深入分析菌株改造后基因表达的情况。具体研究内容和结果如下:（1）非甲醇利用型毕赤酵母高表达重组蛋白菌株的构建通过Cre/lox基因编辑体系,对甲醇代谢调控相关基因进行连续敲除,获得了ΔAOX1-WT,ΔAOX1/2-WT,ΔAOX1/2-ΔMig1-WT,ΔAOX1/2-ΔMig1/2-WT,ΔAOX1/2-ΔMig1/2-ΔNrg1-WT菌株,将这5株菌在甘油和甲醇混合的BMGYM培养基中进行发酵,其中ΔAOX1/2-WT菌株在0.4%甘油+0.5%甲醇的BMGYM培养基中重组蛋白的表达水平是最好的,EGFP表达量较WT在BMMY中提高了53.6%。说明敲除AOX基因之后,有利于菌体提高重组蛋白的合成能力。（2）非甲醇利用型毕赤酵母高表达重组蛋白菌株的转录组学分析利用转录组学方法深入分析了AOX基因敲除之后菌体代谢途径相关基因的表达情况。根据对差异表达基因富集分析的结果显示,基因表达水平变化最多的是细胞的代谢途径和基因信息加工途径,并且这两条途径大部分基因的表达水平都是上调的。菌体通过下调甘油转运蛋白GT1和甘油降解途径相关基因的表达水平,缓解甘油对PAOX1的抑制作用,实现在甘油存在的条件下PAOX1的表达。在细胞代谢途径中菌体通过上调糖酵解途径和PPP途径中的非氧化途径,以及下调TCA循环为菌体代谢提供充足的前体、辅因子以及能量物质。菌体还通过上调蛋白质翻译阶段中核糖体蛋白表达水平和内质网中与蛋白质加工分泌相关的基因,来提高蛋白的分泌表达量。