论文部分内容阅读
第一部分MGE来源外泌体的获取实验目的:分离培养胎鼠内侧神经节隆起（MGE）,提取MGE来源外泌体实验方法:1.成年C57BL/6小鼠进行雌雄鼠合笼交配,次日通过检测雌鼠阴栓情况计算胎龄。2.在体式显微镜下解剖E14.5d胎鼠,识别并分离出MGE组织区域,并通过原代培养神经元的方式进行GABA能中间神经元前体细胞培养。3.利用荧光共聚焦技术对分别培养第0天（即离体当日）、第1天、第3天、第6天的细胞进行细胞分化检测。4.利用超高速离心技术提取细胞培养液中细胞分泌的外泌体。5.利用Western Blot联合纳米颗粒跟踪分析（NTA）技术及透射电子显微镜技术鉴定外泌体。实验结果:1.在显微镜下成功识别并分离出MGE组织。2.观察细胞培养至第6天,显微镜下观察到细胞突起明显,细胞间形成连接。3.细胞培养至第6天,前体细胞特异性标志物Nkx2.1、神经元树突标志物MAP2、GABA能神经元标志物GAD67共定位明显。4.在透射电子显微镜下观察到直径在100-140nm的茶托样或球状颗粒,NTA检测支持以上结果,外泌体特异性标志物CD9和TSG101阳性表达。实验结论:E14.5 d胎鼠的内侧神经节隆起组织进行离体培养,可在培养第6天形成许多明显的细胞连接,并分化为GABA能神经元。此时,培养基中能分离得到具有完整膜结构和活性的茶托样或球状外泌体。第二部分MGE来源外泌体对Li Cl-Pilo诱导的癫痫持续状态及癫痫发作的影响实验目的:检测MGE来源外泌体对Li Cl-Pilo诱导的癫痫持续状态及癫痫动物行为学的影响实验方法:1.海马内立体定向注射外泌体或PBS,在此基础上建立匹罗卡品癫痫持续状态小鼠模型,观察比较行为学。2.匹罗卡品诱发癫痫持续状态以后,经海马内置管每天给予外泌体或PBS溶剂,连续7天。视频监测模型鼠自发性癫痫发作情况,用Racine评分评估发作级别,统计潜伏期,自发性发作次数以及每次发作的持续时间。实验结果:1.匹罗卡品诱导的癫痫持续状态模型中,海马内注射外泌体组小鼠出现癫痫持续状态的潜伏期比对照组明显延长（**P＜0.01）;PBS组与Na?ve组相比较,潜伏期无统计学差异（P＞0.05）。2.匹罗卡品诱导的慢性癫痫模型中,海马内注射外泌体组小鼠出现自发性发作次数比PBS组显著降低（*P＜0.05）,潜伏期明显延长（*P＜0.05）。各组间每次自发性发作的持续时间无明显差异（P＞0.05）;PBS组与Na?ve组相比较,小鼠出现自发性发作潜伏期、发作次数、每次发作持续时间均没有统计学差异（P＞0.05）。实验结论:MGE来源的外泌体能延长匹罗卡品诱导的癫痫持续状态发作的潜伏期。在慢性癫痫发作过程中,反复给予外泌体干预,可以有效延长首次出现自发性发作的潜伏期,减少自发性发作的次数。综上,MGE来源外泌体海马内注射干预能有效延长模型鼠癫痫持续状态出现的时间,延缓慢性期癫痫首次发作的时间,减少自发性发作的次数。第三部分外泌体来源TSP-1对海人酸诱导的慢性癫痫以及戊四氮诱导的慢性点燃动物行为学及场电位的影响实验目的:本课题组前期发现癫痫患者血清外泌体中血小板反应蛋白（TSP-1）表达降低,同步测定癫痫患者与实验动物脑组织外泌体中TSP-1的表达,所得结果与血中结果相一致。本部分将探讨外泌体来源TSP-1是否影响了癫痫的发作。实验方法:1.海马内病毒注射:以序列5’-ga CGCATGACTGCAACAAGAA-3’为目的靶点,以慢病毒为载体通过抑制或增强目标蛋白转录水平来下调或上调蛋白表达。成年雄性C57BL/6小鼠随机分为5个组（n=10）,利用立体定位仪分别进行双侧海马内定向注射TSP-1 RNA干扰病毒（LV-sh-TSP-1）、干扰病毒阴性对照（Con-LV-sh-TSP-1）、TSP-1过表达病毒（LV-TSP-1）及过表达病毒阴性对照（Con-LV-TSP-1）（单侧海马各0.5ul）,对照组注射同等体积的生理盐水。2.建立海人酸模型:待病毒起效后（病毒注射10天）,各组小鼠右侧海马内给予海人酸（200ng）注射诱导癫痫持续状态,利用行为学视频监测模型小鼠的癫痫发作情况,4周后进行海马内局部场电位记录。3.在完成步骤1的基础上,待病毒起效后,各组小鼠腹腔注射阈下剂量PTZ（35mg/kg）点燃,每隔48 h点燃1次,共15次,观察比较点燃过程中的发作分级,4级以上发作的总次数和首次出现4级发作的潜伏期。实验结果:1.在海人酸诱导的慢性自发性癫痫发作（SRS）中,行为学观察发现,与空病毒组相比,LV-sh-TSP-1组首次出现自发性癫痫发作的潜伏期明显缩短（***P＜0.001）,癫痫发作总次数明显增多（**P＜0.01）;LV-TSP-1组首次出现自发性癫痫发作的潜伏期明显延长（***P＜0.001）,癫痫发作总次数明显减少（***P＜0.001）。海马内局部场电位记录结果发现,与空病毒组相比,LV-sh-TSP-1组30分钟内癫痫样放电事件（seizure-like events,SLEs）的总次数（***P＜0.001）和总时间（*P＜0.05）明显增加;LV-TSP-1组SLEs总次数（***P＜0.001）和总时间（*P＜0.05）明显减少,单次癫痫样放电持续时间无明显变化（P＞0.05）,与行为学表现一致。2.在戊四氮诱导的慢性自发性发作中,行为学观察发现,与空病毒队照组相比,LV-sh-TSP-1组各时间点的平均发作分级较高（*P＜0.05）,4级及以上发作总次数明显增多（**P＜0.01）,首次4级发作潜伏期明显缩短（***P＜0.001）,LV-TSP-1组显示了相反的结果。3.待行为学和局部场电位观察完后,提取各组小鼠海马组织,Western Blot检测病毒的持续效应,与空病毒组相比,LV-sh-TSP-1组TSP-1蛋白表达水平降低（**P＜0.01）,LV-TSP-1组TSP-1蛋白表达水平增高（***P＜0.001）,与行为学和局部场电位表现一致。实验结论:1.海马内立体定向注射病毒能显著改变海马内TSP-1蛋白表达水平,其调控效能将持续至实验结束。2.通过两种动物模型证实,在癫痫发生发展过程中,TSP-1的表达变化可影响癫痫发作,减少TSP-1表达使癫痫发作加重,增加TSP-1表达使癫痫发作减轻。综上,上调海马内TSP-1蛋白表达,对癫痫发作有保护作用。