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蛋白质尤其是疾病标志物蛋白的检测分析一直以来备受关注与重视。随着生物学与分析化学、材料学、医学等学科的交叉渗透,生物传感器这一多学科交叉领域得到了飞速发展,涌现了各类针对蛋白质分析的新型生物传感器。目前蛋白质生物传感主要利用抗体和核酸作为敏感元件,而且这些生物传感器在实际蛋白质分析应用中仍具有很多局限性,因此需要引入新的分子识别和信号转换元件,构建新的传感体系,以提升传感器的检测性能,为蛋白质的分析检测提供更加丰富多样的选择。本论文以多肽作为分子识别和信号转换及放大元件,采用电化学技术,通过研制多种蛋白质靶向探针和信号标签,并且结合一些新颖的信号放大技术,构建了一系列新型高灵敏蛋白质电化学生物传感器,并初步应用于临床实际样本的检测分析,验证了这些传感器的优良性能和临床应用潜能。研究工作分为以下几个部分:1.基于新型多肽纳米信标和捕获探针的蛋白质定量新方法我们基于新型多肽纳米信标和捕获探针构建了一种灵敏的蛋白质定量检测新方法。该多肽纳米信标通过在链霉亲和素包被的金纳米颗粒表面修饰电化学活性多肽构建而成,捕获探针是以靶蛋白特异性结合多肽为基础所构建,而纳米信标与捕获探针联合使用可实现对蛋白质的灵敏、特异性检测。检测过程中,靶蛋白首先特异性地与预修饰于金电极表面的捕获探针结合,保护其免受嗜热菌蛋白酶的切割,因此而保留下来的捕获探针通过生物素与链霉亲和素之间的高亲相互作用而与纳米信标相结合,引发了纳米信标与金电极之间的电子传递,继而产生了与靶蛋白的量成正比的放大信号输出。本文提出的方法在对肝细胞癌的重要标志物——磷脂酰肌醇蛋白-3(GPC3)的检测中得到了很好的验证,根据本方法测得的血清中GPC3的水平,可以有效地区分肝细胞癌与其它肝脏病变。基于其在分析方面的优势及在实际样本中的应用价值,本方法在未来的临床实践中具有很大的潜能和应用前景。2.基于DNA核酶催化多肽纳米信标界面组装的蛋白质定量新方法我们基于高效的DNA核酶催化多肽纳米信标界面组装构建了 一种灵敏的蛋白质检测新方法。在起始状态下,靶蛋白的适体序列与DNA核酶序列杂交而封闭DNA核酶活性,当靶蛋白识别并结合其适体序列时,DNA核酶序列即被释放激活。与此同时,我们将具有5’-羟基末端的核酶底物序列预修饰于金电极表面,经DNA核酶的切割作用之后产生5’-磷酸末端,从而与具有强磷酸根亲和力的氧化锆纳米颗粒连接。氧化锆纳米颗粒预先修饰了大量的信号分子——铜肽GHK,基于铜肽对于铜离子的结合作用可以产生大量的电化学信号用于靶蛋白的灵敏分析。除了具有高灵敏性和简便快捷的优势之外,本方法还具有通用性,只需替换一下适体序列即可用于分析多种靶标分子。因此本方法在构建临床生物分析超灵敏生物传感器方面具有很大的应用潜能。3.基于新型多功能纳米催化剂的蛋白质定量检测新方法组织型转谷氨酰胺酶2(TGM2)是一种新发现的肿瘤标志物,可以作为甲胎蛋白的补充以提高临床水平肝细胞癌的诊断性能。在本工作中,我们基于新型多功能纳米催化剂构建了一种针对TGM2的超灵敏电化学检测方法,旨在联合甲胎蛋白的检测以提高临床水平肝细胞癌的诊断性能。首先,我们通过在石墨烯上修饰聚赖氨酸和铜离子来功能化羧基石墨烯以合成一种电化学纳米催化剂。这种新型纳米催化剂一方面可以作为TGM2的底物,一方面可以催化电化学信号放大实现对靶标的高灵敏检测。然后,我们将TGM2特异性的谷氨酰胺供体多肽修饰于金电极表面,TGM2的转酰胺基作用可以将纳米催化剂与电极上的多肽连接,从而得到明显的电化学信号,进而实现对TGM2的简便灵敏检测。进一步研究表明,在对肝细胞癌病人血清样本的分析中,本方法显示出了很好的检测性能及潜在的临床诊断应用价值。4.基于催化活性多肽卷曲螺旋结构的蛋白质定量检测新方法形成卷曲螺旋的多肽互补配对可以实现很多有趣的生物传感应用,而两条多肽链的互补配对可能会通过对一定长度的肽链的环化而得到抑制,因此,我们基于催化活性多肽卷曲螺旋结构实现了对蛋白质的灵敏定量及活性分析。与其同时,为了把这种可共价控制的构型变化转化为信号输出,我们把一段铜离子结合多肽模体分裂到两段互补的多肽链中,因此铜离子的结合或者解离以及由其导致的催化能力的获得或者丧失就总是与两段互补多肽链的配对与分离相伴而生。经过巧妙设计的多肽探针经靶蛋白酶的作用后,可以发生构象的变化,最终互补配对形成一种修饰了的卷曲螺旋结构,这种结构的形成同时会导致铜离子结合模体的形成,进而可以将以上的分子识别及结构变化转化为放大的信号输出。在对肿瘤标志物血纤维蛋白溶酶的检测中,本方法表现出了很好的检测性能,有望在肿瘤发生、发展研究及临床检测方面加以应用。5.基于新型肽适体的蛋白质定量检测新方法我们设计了一种新型多肽探针实现了对蛋白质的灵敏检测,这种多肽探针被命名为“肽适体”,它可以伴随蛋白以及一些其他配体的结合发生构象变化以及催化功能的激活与失活。这种肽适体是通过巧妙地整合几种具有靶向及催化能力的多肽模体构建而成的,因此,肽适体对蛋白质的靶向结合可以通过一种人工配体来调节。此外,蛋白质和人工配体诱导的的肽适体结构的重排会导致肽适体对催化辅因子(铜离子)的亲和力改变,这会在蛋白质存在与不存在的条件下产生很大的催化效率差异。这种显著的催化活性开或关的转变可以实现甲状腺癌临床组织中整合素表达水平的生物分析。实验结果表明,使用本方法所检测到的整合素水平与淋巴结转移状态平行。此外,这里的简单多肽模体有助于理解细胞信号转导相关蛋白的结构重构,为在病理条件(例如癌症)下评估蛋白质的表达水平与活性提供新的途径。