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A型流感病毒能够对人、家禽和鸟类等造成急性呼吸道感染，对公共卫生健康和全球经济稳定造成潜在威胁。流感病毒的高致死率和潜在的跨种传播能力值得引起我们的关注。现有的针对季节性流感毒株的疫苗在公共卫生体系中起到了重要的作用，但是流感病毒传播速度快，重组率高的特点，对疫苗和药物的研发提出了艰巨挑战。在流感病毒感染的过程中，病毒的逃逸、复制、增殖及其引发的炎症等均离不开病毒自身与宿主蛋白的相互作用。考虑到病毒在传播和建立感染的过程中会发生突变和适应性变化，病毒对于抗病毒药物的耐药变异速率会比针对宿主治疗药物的耐药变异速率要快，因此靶向流感病毒宿主相关因子的研究是寻求流感病毒新的药物靶标和治疗策略的一种思路。
本文首先研究了流感病毒聚合酶对宿主干扰素信号通路的调控作用，我们发现流感病毒聚合酶蛋白PA亚基能够抑制宿主干扰素的产生。PA亚基通过与宿主干扰素调节因子3(Interferon regulatory factor 3，IRF3)互作，抑制IRF3的激活和入核，从而抑制宿主干扰素的生成。之后构建了基于规律间隔成簇短回文重复序列(Clustered regular interspersed short palindromic repeats，CRISPR)的全基因组敲除文库，采用H7N9禽流感病毒感染，鉴定H7N9感染和增殖相关的必需宿主因子，主要研究成果如下：
1.流感病毒PA亚基拮抗宿主干扰素的产生
本研究构建了不同亚型流感病毒PA蛋白的过表达质粒，包括pdm/09PA(A/Mexico/4486/2009)、F9PA(A/swine/Nanchang/F9/2010(H1N1))、H5N1PA(A/duck/Hubei/Hangmei01/2006(H5N1))和H7N9PA(A/Shanghai/02/2013(H7N9))，转染293T细胞进行干扰素转录活性检测发现，不同亚型的流感病毒PA均能够抑制宿主干扰素的转录活性。随后研究了宿主干扰素信号通路关键接头分子在流感病毒PA过表达时的转录活性，发现流感病毒PA能够抑制IRF3上游一系列接头分子，包括RIG-I、MDA5、MAVS和TBK-1激活的IFN的转录，但对NF-kappaB通路上游信号分子激活的IFN的转录没有明显抑制作用，暗示流感病毒对宿主干扰素的调控依赖于IRF3的信号通路。免疫共沉淀和间接免疫荧光试验证实，流感病毒PA能够与宿主IRF3互作，抑制了宿主IRF3的激活，从而抑制了干扰素的产生，IRF3与PA之间的相互作用依赖于PA第108位的天冬氨酸。
2.H7N9禽流感病毒增殖相关宿主基因筛选
为了深入探究流感病毒与宿主因子在感染过程中的相互作用，本研究采用慢病毒感染A549细胞构建了全基因组敲除文库，测序显示构建的文库均一性和覆盖率较好。随后采用H7N9禽流感病毒感染了文库细胞进行抗病毒相关基因的筛选，最终获得存活细胞进行gDNA的提取，扩增和测序分析。根据MAGeCK(Model-based Analysis of Gene Essentiality)分析，本研究选取了在筛选中显著富集的50个基因，构建了50个基因对应的敲除细胞系，并感染H7N9流感病毒进行初步验证。结果表明，排名前30基因对应的敲除细胞系对H7N9病毒感染宿主的进程表现为不同程度的延缓作用，证实全基因组敲除文库建立和筛选方法的可靠性。
后续研究选取了对H7N9禽流感病毒感染进程延缓显著的14个候选基因敲除细胞系进行纯化，将获得的单克隆细胞系感染H7N9病毒，结果表明这14个候选基因敲除细胞系均能够显著抑制H7N9病毒的增殖。根据流感病毒在宿主体内的生命周期，本研究进一步检测了这14个候选基因敲除细胞系对流感病毒吸附、入侵和转录复制活性的影响。结果表明，SLC35A1、CMAS、GNE和NANS敲除细胞系阻断了病毒的吸附；CYTH2和ABCD2敲除细胞系减弱了病毒的内吞；SLC35A2、MIIP、CYTH2、RNASE8、HLA-G、ABCD2和ST18敲除细胞系抑制了流感病毒聚合酶的活性。本研究中鉴定了参与宿主唾液酸合成和转运的关键宿主基因SLC35A1、CMAS、GNE、SLC35A2和NANS，其中NANS作为唾液酸通路的重要合成酶，参与流感病毒的增殖为本研究首次报导。
为了进一步确认本研究筛选的基因对禽流感病毒的调控作用，选取了NANS、CYTH2、TTC24和HIFX这4个基因缺失的细胞系，用逆转录病毒分别回补对应敲除的基因，结果显示CYTH2、TTC24和NANS的回补可以回复对应基因缺失造成的对H7N9流感病毒增殖的抑制效应。以上结果表明，全基因组敲除文库技术是鉴定流感病毒相关宿主因子的有力工具。
3.候选基因CYTH2参与流感病毒内吞机制的研究
本研究发现候选基因CYTH2敲除的细胞系能够显著抑制流感病毒的增殖，但CYTH2的敲除不影响流感病毒吸附到宿主细胞表面，而是影响了随后的病毒入侵事件。而且逆转录病毒介导的CYTH2的回补能够回复CYTH2敲除对H7N9流感病毒增殖的抑制效应。回补不同功能缺失的CYTH2突变体对于H7N9的增殖仍有不同程度抑制作用。此外，用CYTH2的选择抑制剂SecinH3处理细胞后再感染H7N9，也能抑制H7N9的增殖。因此，本研究表明，CYTH2的完整结构和功能对于禽流感病毒的入侵是必需的。
为了进一步解析CYTH2在流感病毒入侵过程中发挥的作用，本研究用荧光标记的流感病毒感染CYTH2敲除的细胞系，通过动态观察发现，CYTH2敲除细胞系在感染的过程中，阻止了病毒和内吞体的膜融合的过程，影响了后续病毒从内吞体中的释放。应用电镜观察发现，CYTH2敲除细胞系中，病毒粒子在内吞运输的过程中会停留在内吞泡中，无法实现病毒囊膜与内吞体的融合，从而抑制了病毒粒子的释放，最终抑制了流感病毒的增殖。此外，进一步评价CYTH2对DNA病毒入侵的效果时，发现CYTH2基因敲除细胞系同样抑制了伪狂犬病毒和疱疹病毒的增殖。这个结果表明，CYTH2是一种RNA病毒(禽流感病毒)和DNA病毒(伪狂犬病毒和疱疹病毒)入侵的必需基因，可作为治疗多种病毒感染的潜在药物靶标。
本文首先研究了流感病毒聚合酶对宿主干扰素信号通路的调控作用，我们发现流感病毒聚合酶蛋白PA亚基能够抑制宿主干扰素的产生。PA亚基通过与宿主干扰素调节因子3(Interferon regulatory factor 3，IRF3)互作，抑制IRF3的激活和入核，从而抑制宿主干扰素的生成。之后构建了基于规律间隔成簇短回文重复序列(Clustered regular interspersed short palindromic repeats，CRISPR)的全基因组敲除文库，采用H7N9禽流感病毒感染，鉴定H7N9感染和增殖相关的必需宿主因子，主要研究成果如下：
1.流感病毒PA亚基拮抗宿主干扰素的产生
本研究构建了不同亚型流感病毒PA蛋白的过表达质粒，包括pdm/09PA(A/Mexico/4486/2009)、F9PA(A/swine/Nanchang/F9/2010(H1N1))、H5N1PA(A/duck/Hubei/Hangmei01/2006(H5N1))和H7N9PA(A/Shanghai/02/2013(H7N9))，转染293T细胞进行干扰素转录活性检测发现，不同亚型的流感病毒PA均能够抑制宿主干扰素的转录活性。随后研究了宿主干扰素信号通路关键接头分子在流感病毒PA过表达时的转录活性，发现流感病毒PA能够抑制IRF3上游一系列接头分子，包括RIG-I、MDA5、MAVS和TBK-1激活的IFN的转录，但对NF-kappaB通路上游信号分子激活的IFN的转录没有明显抑制作用，暗示流感病毒对宿主干扰素的调控依赖于IRF3的信号通路。免疫共沉淀和间接免疫荧光试验证实，流感病毒PA能够与宿主IRF3互作，抑制了宿主IRF3的激活，从而抑制了干扰素的产生，IRF3与PA之间的相互作用依赖于PA第108位的天冬氨酸。
2.H7N9禽流感病毒增殖相关宿主基因筛选
为了深入探究流感病毒与宿主因子在感染过程中的相互作用，本研究采用慢病毒感染A549细胞构建了全基因组敲除文库，测序显示构建的文库均一性和覆盖率较好。随后采用H7N9禽流感病毒感染了文库细胞进行抗病毒相关基因的筛选，最终获得存活细胞进行gDNA的提取，扩增和测序分析。根据MAGeCK(Model-based Analysis of Gene Essentiality)分析，本研究选取了在筛选中显著富集的50个基因，构建了50个基因对应的敲除细胞系，并感染H7N9流感病毒进行初步验证。结果表明，排名前30基因对应的敲除细胞系对H7N9病毒感染宿主的进程表现为不同程度的延缓作用，证实全基因组敲除文库建立和筛选方法的可靠性。
后续研究选取了对H7N9禽流感病毒感染进程延缓显著的14个候选基因敲除细胞系进行纯化，将获得的单克隆细胞系感染H7N9病毒，结果表明这14个候选基因敲除细胞系均能够显著抑制H7N9病毒的增殖。根据流感病毒在宿主体内的生命周期，本研究进一步检测了这14个候选基因敲除细胞系对流感病毒吸附、入侵和转录复制活性的影响。结果表明，SLC35A1、CMAS、GNE和NANS敲除细胞系阻断了病毒的吸附；CYTH2和ABCD2敲除细胞系减弱了病毒的内吞；SLC35A2、MIIP、CYTH2、RNASE8、HLA-G、ABCD2和ST18敲除细胞系抑制了流感病毒聚合酶的活性。本研究中鉴定了参与宿主唾液酸合成和转运的关键宿主基因SLC35A1、CMAS、GNE、SLC35A2和NANS，其中NANS作为唾液酸通路的重要合成酶，参与流感病毒的增殖为本研究首次报导。
为了进一步确认本研究筛选的基因对禽流感病毒的调控作用，选取了NANS、CYTH2、TTC24和HIFX这4个基因缺失的细胞系，用逆转录病毒分别回补对应敲除的基因，结果显示CYTH2、TTC24和NANS的回补可以回复对应基因缺失造成的对H7N9流感病毒增殖的抑制效应。以上结果表明，全基因组敲除文库技术是鉴定流感病毒相关宿主因子的有力工具。
3.候选基因CYTH2参与流感病毒内吞机制的研究
本研究发现候选基因CYTH2敲除的细胞系能够显著抑制流感病毒的增殖，但CYTH2的敲除不影响流感病毒吸附到宿主细胞表面，而是影响了随后的病毒入侵事件。而且逆转录病毒介导的CYTH2的回补能够回复CYTH2敲除对H7N9流感病毒增殖的抑制效应。回补不同功能缺失的CYTH2突变体对于H7N9的增殖仍有不同程度抑制作用。此外，用CYTH2的选择抑制剂SecinH3处理细胞后再感染H7N9，也能抑制H7N9的增殖。因此，本研究表明，CYTH2的完整结构和功能对于禽流感病毒的入侵是必需的。
为了进一步解析CYTH2在流感病毒入侵过程中发挥的作用，本研究用荧光标记的流感病毒感染CYTH2敲除的细胞系，通过动态观察发现，CYTH2敲除细胞系在感染的过程中，阻止了病毒和内吞体的膜融合的过程，影响了后续病毒从内吞体中的释放。应用电镜观察发现，CYTH2敲除细胞系中，病毒粒子在内吞运输的过程中会停留在内吞泡中，无法实现病毒囊膜与内吞体的融合，从而抑制了病毒粒子的释放，最终抑制了流感病毒的增殖。此外，进一步评价CYTH2对DNA病毒入侵的效果时，发现CYTH2基因敲除细胞系同样抑制了伪狂犬病毒和疱疹病毒的增殖。这个结果表明，CYTH2是一种RNA病毒(禽流感病毒)和DNA病毒(伪狂犬病毒和疱疹病毒)入侵的必需基因，可作为治疗多种病毒感染的潜在药物靶标。