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A型流感病毒(Influenza A virus,IAV)的病毒核糖核蛋白(Viralribonucleoprotein, vRNP)负责病毒基因组在细胞核中的转录和复制。vRNP从细胞质进入细胞核的过程是IAV生命周期中十分重要的步骤，vRNP的入核过程需要借助许多宿主蛋白，而关于此方面报道的宿主蛋白并不多。研究参与vRNP入核相关的宿主蛋白，不仅可以揭示IAVvRNP核输入的分子机制，而且还能为抗病毒药物的研发提供潜在靶标。
先前研究表明，真核生物翻译延长因子1δ(Eukaryotic translation elongation factor 1 delta, eEF1D)与RNP亚基相关，但是其在IAV复制过程中的作用尚不清楚。本研究表明eEF1D可以负调控IAV生命周期，敲除细胞中的eEF1D会导致病毒的产量显著升高。eEF1D与所有RNP亚基发生相互作用，阻碍了IAV的NP蛋白和PA-PB1异源二聚体的入核，从而抑制了vRNP的组装、聚合酶活性和病毒RNA的合成。主要内容如下：
1．eEF1D抑制IAV的复制
本研究通过过表达eEF1D检测了其对IAV复制的影响。实验结果显示eEF1D能抑制IAV的复制。我们进一步利用siRNA和CRISPR/Cas9分别敲低和敲除了A549细胞中内源性的eEF1D，分别研究其对人流感PR8/H1N1、禽流感HM/H5N1、猪流感HB/H1N1病毒复制的影响。实验结果表明敲低或者敲除eEF1D后，均能显著提高PR8/H1N1、HM/H5N1、HB/H1N1病毒的复制滴度，且在蛋白水平促进NP蛋白的合成，说明eEF1D是IAV的负调控因子。
2．eEF1D与vRNP存在相互作用
免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation，Co-IP)的实验结果显示eEF1D能与RNP所有亚基(PA、PB1、PB2、NP)在转染条件下发生互作，且与NP蛋白以RNA依赖的方式结合。进一步在细胞感染IAV条件下证实eEF1D与病毒PA、PB1、PB2、NP的相互作用真实存在，且与NP的互作是RNA介导。此外，在共转染的条件下，eEF1D与PA、PB1、NP于细胞质共定位，且NP蛋白出现胞质滞留的情况；病毒感染情况下，eEF1D与PA、PB1、NP在细胞质共定位，和PB2在细胞质也存在少量的共定位。研究结果表明eEF1D改变了NP蛋白定位的情况，提示eEF1D可能在调控vRNP亚基的入核方面发挥重要作用。
3．eEF1D抑制NP蛋白和PA-PB1二聚体的核输入
检测eEF1D对IAV的NP蛋白入核的影响。间接免疫荧光实验和核质分离实验结果共同表明eEF1D能抑制IAVNP蛋白的核输入。而eEF1D的抑制作用是通过破坏NP蛋白与importinα5的相互结合来实现的。因为RNP各亚基的入核方式差异很大，我们还研究了eEF1D对PA-PB1异源二聚体、PB2蛋白入核的影响。结果显示eEF1D通过干扰PB1与RanBP5的相互作用抑制了IAV的PA-PB1异源二聚体的核输入，而对于PB2的入核没有明显影响。以上结果提示，eEF1D可能抑制IAV新产生的vRNP的入核。
4．eEF1D抑制vRNP的核输入过程
检测eEF1D对IAV的vRNP入核的影响。通过siRNA和CRISPR/Cas9技术对内源的eEF1D进行特异性的敲低和敲除，在放线菌酮(Cycloheximide，CHX)处理和不处理的条件下，感染PR8/H1N1病毒2h后观察NP的定位变化。激光共聚焦显微镜观察和统计分析的结果显示，无论CHX对细胞处理或者不处理，敲低和敲除eEF1D后均能显著促进IAV的vRNP的入核过程。对敲除eEF1D后的细胞进行蛋白水平的检测也得到相同结果，说明eEF1D可以抑制IAV的vRNP的入核过程。
5．eEF1D抑制vRNP的组装和RNAs的合成
进一步研究发现eEF1D可以抑制IAV的NP蛋白寡聚化，且抑制了聚合酶PA、PB1和PB2三元复合物的形成，最终导致vRNP的组装过程受到影响。vRNP是IAV转录复制进行的最小功能单位，接下来，我们研究了eEF1D过表达及其敲除对病毒vRNA、cRNA、mRNA的影响。荧光定量PCR检测结果表明过表达eEF1D显著抑制IAV的vRNA、cRNA、mRNA合成，而eEF1D敲除后能显著促进IAV的三种RNAs的合成，说明IAV的转录复制受到影响。
6．eEF1D的N端和C端均能调控IAV的复制
eEF1D作为翻译延长因子有两个重要的功能域：位于N端的亮氨酸拉链区，主要在蛋白质结合方面发挥作用；位于C端的鸟嘌呤核苷酸交换因子区域，主要是催化GDP和GTP的交换。为确定eEF1D上调控IAV复制的关键区域，将eEF1D分成eEF1D-1(N端)和eEF1D-2(C端)，间接免疫荧光实验结果显示，eEF1D的N端和C端在细胞中的定位同全长一样，没有发生改变，均在细胞质中定位；双荧光素酶的实验结果显示eEF1D-1和eEF1D-2均能抑制IAV的聚合酶活性。进一步的荧光定量PCR检测结果也表明，eEF1D-1和eEF1D-2均能显著抑制IAVNP的mRNA水平。上述结果说明eEF1D的N端和C端在调控IAV的复制过程中均发挥调节作用。
总之，本研究表明eEF1D可以与流感病毒的vRNP发生相互作用，且通过抑制RNP亚基的核输入来负调控IAV复制，这不仅揭示了eEF1D在IAV复制中的新作用，而且还为vRNP蛋白的核输入机制提供了新见解。
先前研究表明，真核生物翻译延长因子1δ(Eukaryotic translation elongation factor 1 delta, eEF1D)与RNP亚基相关，但是其在IAV复制过程中的作用尚不清楚。本研究表明eEF1D可以负调控IAV生命周期，敲除细胞中的eEF1D会导致病毒的产量显著升高。eEF1D与所有RNP亚基发生相互作用，阻碍了IAV的NP蛋白和PA-PB1异源二聚体的入核，从而抑制了vRNP的组装、聚合酶活性和病毒RNA的合成。主要内容如下：
1．eEF1D抑制IAV的复制
本研究通过过表达eEF1D检测了其对IAV复制的影响。实验结果显示eEF1D能抑制IAV的复制。我们进一步利用siRNA和CRISPR/Cas9分别敲低和敲除了A549细胞中内源性的eEF1D，分别研究其对人流感PR8/H1N1、禽流感HM/H5N1、猪流感HB/H1N1病毒复制的影响。实验结果表明敲低或者敲除eEF1D后，均能显著提高PR8/H1N1、HM/H5N1、HB/H1N1病毒的复制滴度，且在蛋白水平促进NP蛋白的合成，说明eEF1D是IAV的负调控因子。
2．eEF1D与vRNP存在相互作用
免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation，Co-IP)的实验结果显示eEF1D能与RNP所有亚基(PA、PB1、PB2、NP)在转染条件下发生互作，且与NP蛋白以RNA依赖的方式结合。进一步在细胞感染IAV条件下证实eEF1D与病毒PA、PB1、PB2、NP的相互作用真实存在，且与NP的互作是RNA介导。此外，在共转染的条件下，eEF1D与PA、PB1、NP于细胞质共定位，且NP蛋白出现胞质滞留的情况；病毒感染情况下，eEF1D与PA、PB1、NP在细胞质共定位，和PB2在细胞质也存在少量的共定位。研究结果表明eEF1D改变了NP蛋白定位的情况，提示eEF1D可能在调控vRNP亚基的入核方面发挥重要作用。
3．eEF1D抑制NP蛋白和PA-PB1二聚体的核输入
检测eEF1D对IAV的NP蛋白入核的影响。间接免疫荧光实验和核质分离实验结果共同表明eEF1D能抑制IAVNP蛋白的核输入。而eEF1D的抑制作用是通过破坏NP蛋白与importinα5的相互结合来实现的。因为RNP各亚基的入核方式差异很大，我们还研究了eEF1D对PA-PB1异源二聚体、PB2蛋白入核的影响。结果显示eEF1D通过干扰PB1与RanBP5的相互作用抑制了IAV的PA-PB1异源二聚体的核输入，而对于PB2的入核没有明显影响。以上结果提示，eEF1D可能抑制IAV新产生的vRNP的入核。
4．eEF1D抑制vRNP的核输入过程
检测eEF1D对IAV的vRNP入核的影响。通过siRNA和CRISPR/Cas9技术对内源的eEF1D进行特异性的敲低和敲除，在放线菌酮(Cycloheximide，CHX)处理和不处理的条件下，感染PR8/H1N1病毒2h后观察NP的定位变化。激光共聚焦显微镜观察和统计分析的结果显示，无论CHX对细胞处理或者不处理，敲低和敲除eEF1D后均能显著促进IAV的vRNP的入核过程。对敲除eEF1D后的细胞进行蛋白水平的检测也得到相同结果，说明eEF1D可以抑制IAV的vRNP的入核过程。
5．eEF1D抑制vRNP的组装和RNAs的合成
进一步研究发现eEF1D可以抑制IAV的NP蛋白寡聚化，且抑制了聚合酶PA、PB1和PB2三元复合物的形成，最终导致vRNP的组装过程受到影响。vRNP是IAV转录复制进行的最小功能单位，接下来，我们研究了eEF1D过表达及其敲除对病毒vRNA、cRNA、mRNA的影响。荧光定量PCR检测结果表明过表达eEF1D显著抑制IAV的vRNA、cRNA、mRNA合成，而eEF1D敲除后能显著促进IAV的三种RNAs的合成，说明IAV的转录复制受到影响。
6．eEF1D的N端和C端均能调控IAV的复制
eEF1D作为翻译延长因子有两个重要的功能域：位于N端的亮氨酸拉链区，主要在蛋白质结合方面发挥作用；位于C端的鸟嘌呤核苷酸交换因子区域，主要是催化GDP和GTP的交换。为确定eEF1D上调控IAV复制的关键区域，将eEF1D分成eEF1D-1(N端)和eEF1D-2(C端)，间接免疫荧光实验结果显示，eEF1D的N端和C端在细胞中的定位同全长一样，没有发生改变，均在细胞质中定位；双荧光素酶的实验结果显示eEF1D-1和eEF1D-2均能抑制IAV的聚合酶活性。进一步的荧光定量PCR检测结果也表明，eEF1D-1和eEF1D-2均能显著抑制IAVNP的mRNA水平。上述结果说明eEF1D的N端和C端在调控IAV的复制过程中均发挥调节作用。
总之，本研究表明eEF1D可以与流感病毒的vRNP发生相互作用，且通过抑制RNP亚基的核输入来负调控IAV复制，这不仅揭示了eEF1D在IAV复制中的新作用，而且还为vRNP蛋白的核输入机制提供了新见解。