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川楝素(toosendanin，C30H38O11，FW=574)是从中药川楝树皮(Melia toosendanSieb.et Zucc.)中提取的四环三萜化合物，是楝科植物的主要药效成分。川楝素具有多种药理活性，但是毒理学研究发现川楝素具有明显的肝脏毒性，中医在使用楝科植物时也发现肝脏损伤的现象。本课题通过体内实验和大鼠原代肝脏细胞(primaryrat hepatocytes)模型，研究了川楝素的肝脏毒性和机理，深入探讨凋亡相关通路和氧化应激(oxidative stress)在川楝素肝脏毒性中的作用。我们进一步研究了川楝素对大鼠原代肝脏细胞的MAPKs(mitogen-activated protein kinases)信号转导通路和胞内钙离子的作用，探讨二者对川楝素肝脏毒性的影响。最后初步分析了细胞色素P450混和功能氧化酶(cytochrome P450s，CYP450)在川楝素肝脏毒性中的作用。本课题旨在阐明川楝素肝脏毒性作用机理，为开发利用川楝素和安全用药提供依据。
体内实验发现，ICR小鼠连续3天川楝素灌胃给药后，给药组小鼠血清中的ALT(alanine aminotransferase)和AST(aspartate aminotransferase)水平显著增高，镜检发现肝脏细胞略有肿胀，但未见弥漫性坏死。体内实验结果表明，川楝素是具有潜在肝毒性的化合物。
在体外培养的大鼠原代肝脏细胞，川楝素处理24小时后细胞活力下降，IC50为14.94±0.93μMol/L(n=3)。川楝素可以增加大鼠原代肝脏细胞的caspase 8、9和3的活性，提示川楝素可能激发caspases依赖的细胞凋亡过程。川楝素能引起大鼠原代肝脏细胞的线粒体膜电位下降，胞内ATP水平降低，胞浆中出现细胞色素C(cytochrome c)，提示川楝素造成了肝细胞线粒体损伤，也提示川楝素可能激活线粒体依赖的细胞凋亡。川楝素本身不引起分离大鼠肝脏线粒体的通透性改变(mitochondrial permeability transition，MPT)，MPT的选择性抑制剂环孢菌素(cyclosporin，CsA)也不能对抗川楝素的肝细胞毒性作用，提示川楝素不通过诱发MPT而损伤线粒体。
细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)的增加会造成细胞氧化损伤。川楝素能够诱发离体培养的大鼠原代肝脏细胞内ROS的增加，5、10μMol/L川楝素处理后，原代肝脏细胞内ROS水平在6小时内持续增加。过氧化氢酶(catalase)能增加川楝素处理后的大鼠原代肝脏细胞的胞内ATP水平和细胞活力。抗氧化剂谷胱甘肽(glutathione，GSH)和VitaminC都没有细胞保护作用，而且川楝素处理后的大鼠原代肝脏细胞内的GSH含量没有下降。以上结果说明，川楝素造成大鼠原代肝脏细胞的氧化损伤，川楝素导致ROS大量生成的机制比较复杂。
我们进一步研究了川楝素对大鼠原代肝脏细胞的MAPKs(mitogen-activatedproton kinases)细胞信号转导通路和胞内钙离子浓度的影响。5、10μMol/L川楝素处理1小时内，大鼠原代肝脏细胞内的磷酸化ERK1/2(extracellularsisal-replied kinases1/2)和磷酸化JNK(c-junterminal kinase)的水平升高，但磷酸化p38MAPK的水平不受影响。MEK1/2(mitogen-activatedproteinkinasekinase)抑制剂PD98059能增强川楝素的肝细胞毒性，提示ERK1/2激活能改善川楝素对肝细胞的细胞毒性。JNK抑制剂SP600125能减轻川楝素的肝细胞毒性，提示JNK的激活会损伤肝细胞。上述结果说明MAPKs信号转导通路激活后，对川楝素的肝脏细胞毒性会起不同的作用。川楝素还能增加大鼠原代肝脏细胞的胞内钙浓度，钙离子通道阻断剂硝苯地平(nifedipine)对此没有影响。川楝素增加胞内钙浓度，提示川楝素可能会影响肝脏细胞的多种生理活动。
我们初步研究了CYP450酶以及各亚型抑制剂对川楝素原代肝脏细胞毒性的影响。CYP450酶的非选择性抑制剂SKF-525A、2C6/2C11亚型抑制剂cimetidine和2E1亚型抑制剂diallylsulfide都可以显著抑制川楝素损伤大鼠原代肝脏细胞。川楝素还可诱发大鼠原代肝脏细胞的CYP2E1基因表达增强，提示CYP450酶与川楝素的大鼠原代肝脏细胞毒性密切相关。
综上所述，可以得出如下结论：川楝素是一种具有潜在肝脏毒性的化合物，能够诱发大鼠原代肝脏细胞的凋亡通路激活和ROS生成，川楝素诱发的MAPKs激活对川楝素的原代肝脏细胞毒性产生不同影响，CYP450酶与川楝素的原代肝脏细胞毒性密切相关。我们的研究初步阐明川楝素肝脏毒性的作用特征和机制，为川楝素的开发利用和安全用药提供了依据。