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由于非侵入式、三维成像和可特异性标记成像等不可替代的优势，远场光学显微镜成为当今生命科学中重要研究工具，但是光学衍射极限，限制了人们对亚细胞结构和生物单分子研究的深入。近年来各种光学超分辨技术兴起，其中受激辐射耗尽(STED)显微镜由于具有三维层析能力和较高的时间分辨率，成为现阶段超分辨光学成像技术的重要发展方向。然而，构建STED显微镜技术难度高，国际上只有少数实验室掌握，制约了它与其它技术的联用及其在生命科学研究中的广泛应用。 本论文作者搭建了基于STED的超分辨多功能荧光显微成像系统，该系统可以实现STED超分辨显微成像，共聚焦显微成像，STED与原子力显微镜(AFM)联用成像，荧光寿命成像和基于STED的荧光相关光谱(STED-FCS)测量扩散系数等功能，并实现了细胞膜上膜蛋白扩散运动的STED-FCS表征。 本论文主要工作分为以下四部分: 第一部分，我们在对STED显微镜的基元过程进行了数值计算和模拟的基础上，完成了STED显微镜的搭建。该装置使用了超连续激光光源，发展了简便的波长选择技术和脉冲同步检测与调节技术，实现了STED超分辨成像并使系统更稳定。使用该装置对40nm荧光微球成像时获得了好于50nm分辨率的超分辨图像，进一步将该装置成功应用于细胞体系的研究，能够成功地分辨相距63nm的细胞微丝。 第二部分，我们通过转换数据采集方式、对准方式和改进相应的光路系统，将自主搭建的STED显微镜与商业化的AFM显微镜联用，开发了同时成像和引导成像两种联用成像模式。利用同时成像模式，可以在同一样品位置同时获得样品的形貌特征、力学参数和光学超分辨图像。将同时成像模式应用于人宫颈癌细胞伪足的成像，实验结果表明该联用系统可以有效地应用于细胞研究;利用引导成像模式，实现了STED成像引导AFM成像，并能进一步进行STED与AFM的同时成像。使用STED成像引导AFM成像能够结合两种成像的优点，既能够快速找到感兴趣的区域，又能够准确地获得光学信息和力学参数，我们将引导成像成功地应用于荧光微球的表征。这一可在纳米尺度获得多种信息的联用系统为纳米生物学和纳米医药学研究提供了新的手段。 第三部分，搭建了基于STED超分辨荧光显微镜的FCS系统，系统中的数据采集使用了时间相关的单光子技术方法，降低了系统噪音水平，提高了信噪比。我们研制的STED-FCS装置，成功地将STED-FCS的有效探测体积减小到40aL，是Confocal-FCS有效体积的十分之一。 第四部分，建立了使用STED-FCS研究膜蛋白扩散运动的方法。相比Confocal-FCS，STED-FCS适用的样品浓度更高，可在接近生理条件下直接研究膜蛋白的扩散运动。同时通过使用低重复频率的脉冲激光，有效地减少了单位时间的激发频率，进而减少了光漂白，使得此装置能够有效地表征膜蛋白在细胞膜上的慢速扩散。我们使用STED-FCS系统，测得表皮生长因子受体(EGFR)在细胞膜区的扩散分为快速的三维自由扩散和慢速的二维绑定扩散两部分，其扩散系数分别为82μm2/s和0.59μm2/s。