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目的：
1.从海洋微生物中筛选出1株或几株具有较强抗肿瘤活性的菌株。
2.对筛选出的目的菌株进行分类、鉴定。
3.对目的菌株的培养条件进行优化,并初步分离纯化目的菌株发酵液中抗肿瘤活性物质,为活性物质结构鉴定和进一步利用奠定基础。
方法：
1.通过MTT法从海洋微生物中筛选具有较强细胞毒活性的菌株,并检测目的菌株对正常细胞的毒性。
2.采用圆形纸片法测定该菌株的抗菌活性。
3.通过荧光染色法、DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪(Annexin V-FITC/PI)方法研究菌株发酵液诱导肿瘤细胞凋亡能力。
4.通过形态特征、培养特征、生理生化特征、细胞壁化学成分分析和16SrDNA序列测定,对活性菌株进行分类、鉴定。
5.采用单因子实验和正交设计实验筛选活性菌株的最佳培养基配方；研究温度、种龄、通气量和发酵时间对该菌株的生长和产生抗肿瘤活性物质的影响。
6.采用活性跟踪的方法对活性菌株发酵液中的活性物质进行初步分离纯化。
结果：
1.MTT筛选结果显示,在供试的96株海洋微生物菌株(31株海洋放线菌,63株海洋细菌,2株海洋真菌)中,约13％的放线菌和3％的细菌发酵液具有细胞毒活性；其中放线菌ACMA006细胞毒性很强,且能抑制多种肿瘤细胞的生长。
2.进一步研究表明：菌株ACMA006发酵液对人正常肝细胞LO2的毒性较小,ID50约为2200,对HepG2细胞的毒性较大,ID50约为5000;而且能够抑制革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的生长。经菌株发酵液作用的HepG2细胞,出现典型的凋亡细胞的形态学特征,部分细胞的核收缩、碎裂,形成凋亡小体；有明显的DNA梯形凋亡条带(ladder shape);并且,随着发酵液量的增加,HepG2细胞凋亡率逐渐升高。
3.经过形态特征、培养特征、生理生化特征、细胞壁化学成分分析和16SrDNA序列测定,初步将菌株ACMA006鉴定为链霉菌属中卡伍尔链霉菌华盛顿亚种的一个新的分离菌株。
4.通过单因子实验和正交实验发现放线菌ACMA006的最佳碳氮源浓度为：可溶性淀粉1.5％,甘油1.5％,胰蛋白胨0.5％,酵母膏1％。菌株ACMA006的最适发酵条件为：温度28℃,种龄6d,150mL三角烧瓶中装液量为50mL,发酵时间8d。
5.稳定性实验结果表明,发酵液中抗肿瘤活性物质的热稳定和碱性条件稳定性好,经50℃～100℃处理2h后,或者在pH7～10时,发酵液活性没有明显改变；但pH2～4时,发酵液活性显著下降。乙酸乙酯能够萃取到发酵液中大部分的抗肿瘤活性物质：经薄层层析发现乙酸乙酯相中共有6种组分,其中3个组分对HepG2细胞有较强的毒性。
结论：
1.从96株海洋微生物中筛选得到6株具有细胞毒活性的菌株,其中放线菌ACMA006对肿瘤细胞的毒性很强,对正常细胞毒性较小。
2.菌株ACMA006发酵液具有一定的抑菌活性,且能诱导肿瘤细胞发生凋亡。
3.菌株ACMA006属于链霉菌属,是卡伍尔链霉菌华盛顿亚种的一个新的分离菌株。
4.培养基的成分和培养条件对菌株的生长和产生活性物质的能力会产生不同的影响,优化的培养基能够使菌株ACMA006生长和发酵液中的抗肿瘤活性物质的活性得到最佳发挥。
5.从菌株ACMA006发酵液的乙酸乙酯萃取物中得到3个对HepG2细胞有较强毒性的组分,为活性物质结构鉴定和进一步研发奠定基础。