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非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是以肝脏脂肪浸润、单纯性脂肪变性、脂肪性肝炎、肝纤维化和/或肝硬化以及肝癌为特征的临床综合征。近年来NAFLD的发病率越来越高,且越来越年轻化,全世界大约有15%~30%的成年人患有NAFLD。虽然大部分的非酒精性单纯性脂肪肝(Nonalcoholic fatty liver,NAFL)患者早期并没有出现肝功能损伤的情况,但是大约有1/5的NAFL可能会继续发展成非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis,NASH)、肝硬化甚至肝癌。目前尚未发现防治NAFLD的理想措施,因此,NAFLD已发展为严重危害公众健康的一大问题。NAFLD的发病原因和机理还有争议,目前“多重打击”学说占主导地位,这一学说认为:胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR)和高浓度游离脂肪酸(Free fatty acid,FFA)作为初次打击使得肝内脂质蓄积,导致肝细胞脂肪变性,从而对内、外源性损害因素的敏感性增加;第二次打击主要是活性氧(Reactive oxygen species,ROS)导致的肝细胞氧化应激损伤及相关事件,引起肝脏发生炎性反应和纤维化;第三次打击主要是氧化应激持续存在,炎症-肝细胞坏死恶性循环,导致肝硬化甚至肝癌。由此可见,过量脂肪蓄积是NAFLD发生的必要条件,氧化应激是NAFLD发展的关键。近年来应用减肥药、胰岛素增敏剂、降脂药或抗氧化剂(如维生素E和C)等治疗措施对NAFLD开展了大量的临床研究,但尚未发现对NAFLD疗效明确且无明显副作用的治疗药物。一些黄酮类的植物提取物或植物化学成分具有良好的抗氧化、改善胰岛素抵抗和调节脂质代谢等作用,被认为可能对NAFLD具有防治效果。二氢杨梅素(Dihydromyricetin,DHM)是存在于藤茶中含量很高的一种天然黄酮类植物化合物,已有报道表明其具有调节糖脂代谢、保护高脂对肝脏损伤、改善脂肪肝等作用,但其作用机制还不是很清楚。在NAFLD发生发展过程中,调控脂质合成的关键基因固醇调节元件结合蛋白1c(Sterol regulatory element binding protein-1c,SREBP-1c)、脂肪酸合成酶(Fatty acid synthetase,FAS)、乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-Co A carboxylase,ACC)的表达明显增加。DHM能否下调脂质合成有关基因的表达与活性而改善肝脏脂肪变性还有待进一步研究。本实验室前期开展DHM对NAFLD人群干预研究发现DHM能够改善NAFLD患者的脂代谢及炎症反应,而在体外研究发现DHM也可以通过激活骨骼肌细胞AMPK信号通路改善其胰岛素抵抗。有文献报道,沉默信息调节因子(Silence information regulator1,SIRT1)和/或腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)的激活能够改善肝细胞脂肪变性。因此,本研究提出如下假说:DHM可能通过激活AMPK/SIRT1信号通路,调节肝细胞脂代谢、减少肝细胞的脂肪蓄积,改善肝细胞脂肪变性,成为防治NAFLD的理想植物化合物。本研究深入探讨DHM改善肝细胞脂肪变性的可能分子机制,为NAFLD的防治及有效药物研发提供实验依据。本课题使用0.2mmol/L棕榈酸(Palmitic acid,PA)诱导HepG2细胞24h建立肝细胞脂肪变性模型,继而用不同浓度DHM(0、5、10、20μmol/L)处理24h,首先用油红O染色法、甘油三酯(Triglyceride,TG)含量测定法观察DHM对细胞内脂质蓄积程度的影响;然后用免疫印迹法检测细胞内SIRT1、AMPK、SREBP-1c、FAS、ACC的蛋白表达,q RT-PCR检测SIRT1、SREBP-1c、FAS、ACC m RNA水平;最后,结合SIRT1和AMPK抑制剂、si RNA干扰,进一步探究AMPK/SIRT1信号通路在DHM改善肝细胞脂肪变性中的作用。主要结果和结论如下:(1)PA处理HepG2细胞导致细胞内脂肪蓄积增加,不同浓度的DHM处理后HepG2细胞中TG的含量和脂滴蓄积程度减少,表明DHM具有显著改善HepG2细胞脂肪蓄积的作用。(2)DHM处理脂肪变性的HepG2细胞后导致细胞内脂质合成相关基因SREBP-1c、FAS、ACC的蛋白表达及m RNA水平显著降低,提示DHM通过下调HepG2细胞的脂质合成相关基因的表达与活性,抑制细胞内的脂质合成,改善肝细胞脂肪变性。(3)PA处理HepG2细胞后,SIRT1蛋白和m RNA水平以及AMPK尤其是磷酸化的AMPK蛋白水平显著下降,而DHM处理后磷酸化的AMPK和SIRT1蛋白水平明显增加,说明DHM能够促进AMPK的磷酸化,上调AMPK的活性,同时上调SIRT1的表达而改善肝细胞脂肪蓄积。使用AMPK抑制剂CC抑制AMPK活性、SIRT1抑制剂EX527抑制SIRT1活性或si RNA沉默干扰SIRT1表达后再通过DHM处理,发现DHM改善肝细胞脂肪变性和抑制脂质合成相关基因SREBP-1c、FAS、ACC的蛋白表达的效果被削弱。表明AMPK/SIRT1信号通路在DHM改善肝细胞脂肪变性过程中发挥重要作用。上述研究结果表明,DHM通过调节AMPK/SIRT1信号通路,抑制脂质合成相关基因SREBP-1c、FAS、ACC的表达,改善HepG2肝细胞脂肪蓄积。