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利用2n花粉与单倍性雌配子杂交是选育杨树三倍体的一条重要途径。由于单倍性花粉与2n花粉难以分离,不能纯化,授粉时存在单倍性花粉与2n花粉的竞争而导致三倍体得率低。有关研究表明,三倍体得率低是由于2n花粉的花粉管比正常单倍性花粉的花粉管生长迟缓所致。为揭示2n花粉管生长缓慢的细胞学机理,本研究以毛白杨无性系5088花粉为材料,在筛选适宜离体萌发培养基的基础上,比较分析了LATB处理单倍性花粉以及2n花粉萌发率、花粉管生长速率、花粉管壁物质积累的差异,并就其花粉管胞吞胞吐、超微结构、微丝骨架的排列、Ca2+浓度梯度与花粉管极性生长关系进行了研究。主要研究结果如下: (1)筛选出适宜于毛白杨花粉离体萌发的培养基。通过对含有不同浓度硼酸和氯化钙培养基中的花粉萌发率进行差异显著性分析,发现氯化钙、硼酸以及氯化钙与硼酸间的交互效应均对花粉离体萌发率具有极显著影响。当氯化钙浓度为50mg/L,硼酸浓度为120mg/L时,花粉萌发率最高,为38.21±0.83%,显著高于其它处理组合。筛选出12%蔗糖+50mg/L氯化钙+120mg/L硼酸+0.7%琼脂为毛白杨花粉离体萌发的适宜培养基。 (2)明确了LATB处理对单倍性花粉及2n花粉萌发率、花粉管生长速率、花粉管壁物质积累的影响。LATB处理对毛白杨花粉萌发率、单倍性花粉管以及2n花粉管生长速率、花粉管壁物质积累均有极显著影响。花粉萌发率、花粉管生长速率及花粉管壁体积随着LATB浓度的增大而逐渐减小。在萌发时间和LATB浓度一致的条件下,单倍性花粉管生长速率、花粉管壁体积均远远大于2n花粉管,但2n花粉管壁厚度较单倍性花粉管大。 (3)2n花粉管内FM4-64荧光信号弱于单倍性花粉管,证明2n花粉管顶端胞吞胞吐活动弱于单倍性花粉管。未经BFA处理的单倍性花粉管内荧光较强,但荧光梯度不十分明显;2n花粉花粉管荧光相对弱,但荧光梯度非常明显。随着时间的推移,并未见花粉管内明显荧光动态变化。经BFA处理后,随着BFA浓度的逐渐升高,单倍性花粉和2n花粉花粉管中荧光梯度消失,荧光充满整根花粉管,且强度逐渐减弱。同一BFA浓度下,2n花粉管内荧光较单倍性花粉管弱。 (4)2n花粉管内细胞器结构异常导致细胞壁等前体物质的合成效率低。未经LATB处理的单倍性花粉管顶端存在透明区域,亚顶端含有正常的线粒体、高尔基体等细胞器。与单倍性花粉管相比,未经LATB处理的2n花粉顶端透明区消失,细胞器运动到顶端区域,且膜结构存在一定程度的损伤。随着LATB浓度的升高,花粉管顶端的透明区消失,线粒体和高尔基体数量减少,其膜结构松散。在同一LATB浓度条件下,2n花粉管内细胞器的膜结构破坏更为严重,导致细胞壁等前体物质的合成效率降低。 (5)2n花粉管内微丝骨架聚合程度差,影响细胞器和分泌囊泡的运输。未经LATB处理的单倍性花粉管中微丝聚合良好,呈现典型的平行于花粉管生长方向的束状,2n花粉管内微丝呈现杂乱的网状,聚合程度较单倍性花粉管微丝差。经LATB处理后,单倍性花粉管和2n花粉管内微丝均出现不同程度的解聚。随着LATB浓度的逐渐增大,单倍性花粉管内微丝由平行于长轴方向逐渐变为网状,而2n花粉管内微丝逐渐解聚为颗粒状,严重影响细胞器和分泌囊泡的运输。 (6)2n花粉管内钙离子浓度、浓度梯度较单倍性花粉小,影响分泌囊泡的定向运输与融合。未经LATB处理的单倍性花粉管和2n花粉管内Ca2+均呈现由顶端至基部的梯度变化,但2n花粉管内梯度不如单倍性花粉明显,且Ca2+浓度较单倍性花粉低。随着LATB浓度的升高,单倍性花粉和2n花粉花粉管内的Ca2+浓度梯度逐渐消失,Ca2+浓度逐渐降低,严重影响分泌囊泡的定向运输与融合。 综上,与单倍性花粉管相比,2n花粉管内细胞器结构异常且数量偏少,高尔基体片层及线粒体膜结构遭到一定程度破坏,造成合成细胞壁前体物质的速率较单倍性花粉管低;同时,其钙离子浓度梯度不明显,微丝骨架异常,呈现垂直于生长轴的方向,使高尔基体分泌囊泡定向运输与融合不能够正常进行或速率降低。因此,毛白杨2n花粉管生长缓慢不是受单一因素影响的结果,而是花粉管细胞器,如高尔基体、线粒体,Ca2+浓度梯度以及微丝骨架等因素影响所致。