LCYE RNAi与反义BCH双价植物表达载体的构建及转化中国水仙的研究

• 作 者: 廖正平
• 机 构: 福建农林大学
• 出 处: 福建农林大学
• 发表日期: 2014年01期
• 关键词: 中国水仙 LCYE基因 BCH基因 RNAi 反义技术 双价植物表达载体 遗传转化

中国水仙(Narcissus tazetta var.chinensis)隶属石蒜科水仙属,是法国水仙的变种,主要产于福建、浙江、上海等地,其中以漳州水仙最负盛名,是一类极具观赏价值的经济植物。但由于中国水仙为三倍体,很难自然或人工杂交产生新品种,品种单一、品种退化等问题使中国水仙产业的发展受到很大限制。因此,开展中国水仙品种改良具有重大意义。随着分子生物学的兴起,植物基因工程技术成为中国水仙品种改良的新手段。本研究从漳州水仙花瓣中分离得到花色相关基因LCYE保守区片段,以pCAM1301-antiBCH植物表达载体为基础,构建了LCYE RNAi及反义BCH双价植物表达载体,并在优化中国水仙遗传转化体系的基础上,将其转入中国水仙,获得抗性植株,并进行了分子验证,为开发中国水仙新种质和花色改良提供技术基础和理论参考。主要研究内容及得到的结果如下：1.以中国水仙花葶为外植体,用载体pCAM1301-LCYB转化中国水仙并对预培养时间、筛选方式及共培养基激素组合等因素进行了优化,结果表明：预培养3d,共培养基中激素组合为BA+2,4-D且延迟5d筛选的方式能提高转化效率；2.提取漳州水仙花瓣的RNA,反转录为cDNA,并以此为模板,根据已发表的LCYE基因全长序列设计引物扩增出423bp的LCYE保守片段,并利用pKANNEL质粒及pBI121质粒,以pCAM1301-antiBCH植物表达载体为基础,构建了LCYERNAi及反义BCH双价植物表达载体pCKB-antiBCH-LCYE RNAi;3.以优化了的遗传转化体系为基础,将构建好的pCKB-antiBCH-LCYE RNAi双价植物表达载体转入中国水仙。漳州水仙花葶经预培养3d后,将其浸入含有pCKB-antiBCH-LCYE RNAi质粒的农杆菌中侵染10min,然后在共培养基(MS+2mg·L-1BA+0.5mg·L-12,4-D+100μm·L-1AS+3%蔗糖+0.7%琼脂糖)中暗培养3d,共培养后将外植体转移到不添加选择抗生素的筛选培养基上延迟培养5d后再接入筛选培养基中进行筛选培养得到抗性芽。4.对抗性芽进行了quantitative real-time PCR检测,证明得到了转基因植株并初步研究了导入目的基因的表达。