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霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’ slymphoma，HL)是一类发生在淋巴系统的恶性肿瘤，发生率约占所有原发肿瘤的1％，发达国家主要发生于青壮年，而在发展中国家主要发生于儿童。在最新WHO疾病分类中，根据其组织学特征分为结节性淋巴细胞为主型(nodular lymphocyte predominant HL，NLPHL)和经典型(classical HL，CHL)2种类型。CHL的组织学特征是，在复杂的炎症细胞背景中出现特征性的、有诊断价值的多核巨细胞——RS细胞。RS细胞以及形态与RS细胞相似的单个核细胞(霍奇金细胞)，合称为HRS细胞。HRS细胞和各种变异体细胞是CHL的肿瘤细胞。目前研究认为，在大多数病例中，CHL的肿瘤细胞约98％起源于生发中心的B细胞，约2％来源于T细胞。但有关HRS细胞表型的研究表明，HRS细胞与其起源的生发中心B细胞在表型上有很大不同。那么，是何种机制导致了这种表型改变?该问题的解决在HRS细胞的形态发生学、甚至HL发生学中有重要意义。已知HL的发生与多种病毒的感染有关，其中又以EB病毒的研究最多，但不能用EB病毒解释所有病例，因为约有50％的病例中并不能找到EB病毒感染的证据。二十世纪九十年代以来，黄高昇教授等人用多种方法在EB病毒阴性的HL病例中发现存在HCMV的证据，从而为HL的病因学和发生学的研究开辟了新的途径。 人巨细胞病毒(HCMV)为β疱疹病毒亚家族成员，是一种分布广泛的人类病原体，在健康的儿童和成人通常引起无症状性感染；在某些接受了HCMV污染的血制品人群可引起单核细胞增多症；在胎儿和免疫抑制个体可引起严重的疾病；并与宫颈癌、前列腺癌、结肠癌、卡波西肉瘤、霍奇金淋巴瘤等多种恶性肿瘤的发生有关。HCMV可感染多种细胞，由于HCMV有嗜涎腺性，因此涎腺导管上皮细胞最常受感染。HCMV感染细胞后，不仅可引起宿主细胞发生形态学改变，而且可导致细胞功能的改变。细胞功能的改变又包括与细胞受体相互作用引发的反应、调节宿主细胞的转录和蛋白质合成、影响宿主细胞的增殖、细胞膜的变化、诱导细胞凋亡等。但 第四军医大学博士学位论文有关HCMV对细胞免疫表型影响的研究尚未见报道。 在该课题中，我们首先详尽地研究了HCMV感染对涎腺导管上皮细胞的影响，然后以此结果为疾病对照初步探讨了CHL病例中HRS细胞表型改变及其与HCMV感染的关系。所有这些结果将为深入研究HCMV在CHL HRS细胞免疫表型改变中的作用打下基础。研究内容和结果简述如下: 1、以腮腺巨细胞包涵体病(PCID)为疾病模型初步研究了HCMV感染对腮腺导管上皮细胞的表型所产生的影响。 选取11例腮腺巨细胞包涵体病尸检标本，HE染色后观察发现部分腮腺导管中，柱状上皮细胞细胞体积增大、出现周围有晕包绕的嗜碱性核内包涵体等形态学改变。免疫组织化学法显示绝大多数包涵体巨细胞HCMVD陇9/CCHZ抗原阳性，而且阳性颗粒主要分布于核内包涵体，提示包涵体巨细胞为H咪V感染细胞。进一步研究表明该包涵体巨细胞的免疫学表型发生改变，作为上皮性标志物的上皮细胞膜抗原(EMA)、广谱角蛋白(PanCK)和角蛋白8(c KS)的表达缺失，而角蛋白18(c K18)的表达转为强阳性。 2、为了证实从尸检标本中所得结果，建立了涎腺导管上皮细胞体外感染HC剧模型。 体外培养人涎腺导管上皮细胞(HSG)，该细胞呈上皮样贴壁生长，用免疫细胞化学初步鉴定显示CKS和CK18抗原的表达呈阳性。在人胚肺成纤维细胞(HELF)中繁殖HCMV，并测定其TCID，，。已知滴度的HCMV感染HSG后，用多种方法检测培养细胞中的HCMV。倒置显微镜下观察发现，感染后12小时即可见细胞病变，感染后60小时细胞病变已极为明显，72小时绝大部分细胞出现病变，而对照组保持着良好的生长状态。透射电镜检铡发现在细胞核、内质网、细胞质中出现数量不等的3种不同形态的疤疹病毒样颗粒。RT一PCR及ne st一RT一pCR法在宿主细胞中可检测到HCMVIEI/IEZ基因的转录。免疫细胞化学方法在宿主细胞中可检测到HCMVIEI/IEZ蛋白的表达。 3、探讨了HCMV体内外感染对涎腺导管上皮细胞生长状况的影响。 用免疫组织化学法研究尸检腮腺巨细胞包涵体病组织中PCNA和氏的表达时发现，大部分包涵体巨细胞PCNA呈弱阳性，而包涵体巨细胞氏均阴性。用MTT法研究HCMV对体外培养涎腺导管上皮细胞增殖活性的影 第四军医大学博士学位论文响时发现，HCMV对体外培养的HSG细胞增殖具有抑制作用，且该抑制作用具有剂量依赖性和时间依赖性。进一步用流式细胞仪检测HCMV对体外培养HSG细胞周期的影响时发现，HCMV的抑制作用主要发生在细胞周期的Gl/S关卡，使HSG阻滞于Gl期。用Western blotting检测HCMV感染细胞中周期素Dl的表达时发现，感染病毒的宿主细胞周期素Dl表达下调。用免疫细胞化学法和Western blotting检测HCMV感染细胞中PCNA的表达后发现，HCMV感染细胞中PCNA的表达下调。 4、研究了体外HCMV感染可否引起涎腺导管上皮细胞免疫表型的改变并初步探讨了组织蛋白酶D在涎腺导管上皮细胞免疫表型改变中的作用。 用western blotting法研究HCMv对体外培养的涎?