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研究背景：
2017年，WHO发布一项报告列出严重威胁人类健康的12种耐药细菌，其中鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）位列“榜首”。鲍曼不动杆菌感染人群主要为住院患者，尤其是重症病人，最主要的感染类型为肺炎。多重耐药鲍曼不动杆菌呈世界性流行，使其临床治疗面临严峻挑战。疫苗可从源头上控制耐药细菌的感染与传播，是一种经济有效的防治手段。鲍曼不动杆菌疫苗接种的目标人群主要为住院病人，疫苗接种时间窗口要求很短，希望在接种后3至7天快速起效，尽早产生免疫保护效果。
本课题组前期研究发现，用鲍曼不动杆菌灭活全菌（Invactivated whole cell,IWC）疫苗单次滴鼻免疫小鼠可快速对致死剂量鲍曼不动杆菌攻毒起到100%的保护效果，IWC疫苗的这种快速保护效应在T、B细胞缺陷的Rag1-/-小鼠中同样存在，且宿主应答动力学研究显示疫苗免疫7天后攻毒引发了记忆性应答，提示IWC疫苗的快速免疫保护效应依赖于天然免疫记忆。天然免疫记忆是指天然免疫细胞可在初次免疫暴露后被代谢和表观重编程而储存免疫记忆，再次接受刺激时可呈现增强的宿主防御反应。
mTOR-HIF-1α信号通路可调控多种代谢途径，介导表观遗传重编程，从而诱导天然免疫记忆形成。肺泡巨噬细胞（Alveolar macrophages，AMs）是机体抵御外来病原侵袭肺脏的第一道防线，AMs更新缓慢且能自我维持，为记忆性的形成和维持创造了有利条件。因此推测鲍曼不动杆菌IWC免疫可能驯化AMs形成免疫记忆，在疫苗快速保护中发挥重要作用。然而巨噬细胞具有强异质性，介导单核巨噬细胞免疫记忆的细胞亚群特征尚不清楚，本研究运用单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术尝试解析IWC疫苗免疫后记忆性AMs亚群的特征，并验证其在疫苗保护中的功能，为鲍曼不动杆菌疫苗快速起效提供理论基础。
研究目的：
1.建立小鼠致死性肺炎模型用于疫苗保护性评价。
2.明确肺泡巨噬细胞在鲍曼不动杆菌IWC疫苗快速保护中的作用。
3.初步鉴定疫苗免疫后记忆性肺泡巨噬细胞亚群及其特征。
4.探索mTOR通路在肺泡巨噬细胞介导的鲍曼不动杆菌IWC疫苗快速保护中的作用。
研究方法：
1.分别用30株鲍曼不动杆菌临床分离株对小鼠进行气管插管感染，观察小鼠死亡率初步鉴定其毒力。用MLST方法鉴定临床株的序列型（ST），筛选具有代表性基因型的鲍曼不动杆菌。用高毒力临床株感染小鼠，检测生存率、细菌定植量、组织病理，Real-time PCR检测细胞因子，流式检测BALF炎症细胞浸润，建立小鼠肺炎模型。分别用不同ST型临床株制备IWC，免疫小鼠7天后攻毒，观察生存率。
2.检测B-NDG小鼠IWC单次滴鼻免疫攻毒后生存率，确认天然免疫细胞在IWC疫苗快速保护中的作用。将IWC免疫7天后的小鼠CD11C+AMs用磁珠分选并过继到受体小鼠肺部后攻毒，测定攻毒24小时后的小鼠临床评分和细菌定植量。分别建立体内及体外IWC驯化AMs记忆模型，Real-time PCR检测疫苗免疫7天后AMs细胞因子表达，ELISA检测IWC再刺激2小时后的TNF-α水平。IWC免疫小鼠腹腔注射TNF-α抗体后攻毒，观察生存率。Real-time PCR检测IWC免疫7天后AMs中吞噬杀菌相关标志基因的表达水平；分别用流式检测IWC免疫后攻毒1小时、2小时的AMs吞噬GFP鲍曼不动杆菌的能力。
3.流式检测IWC单次滴鼻免疫0、7、14、30天时，小鼠BALF中AMs的动态变化。对IWC免疫7天后和未免疫小鼠的肺组织进行单细胞转录组测序，对肺组织细胞进行聚类分群，统计免疫后肺组织细胞亚群数目和比例的变化，分析IWC免疫对小鼠肺部细胞的影响。进一步对其中的单核巨噬细胞进行分群定义以及拟时轨迹、细胞亚群特征表达基因分析。Real-time PCR验证scRNA-seq结果中AMs亚群的特征性表达基因。
4.IWC免疫7天后，分别用WB、Real-time PCR、流式检测肺组织和AMs中的mTOR通路的激活情况。在IWC免疫阶段腹腔注射雷帕霉素抑制mTOR通路，观察小鼠免疫攻毒后生存率；检测攻毒24小时后肺组织和血中的细菌定植量，以及肺组织病理；ELISA检测肺和血中的细胞因子表达水平。
研究结果：
第一部分：鲍曼不动杆菌临床菌株分离鉴定及肺炎模型的建立
1.30株临床菌中有23株可引起小鼠死亡，其中6株可引起100%致死，而SJZ24是其中毒力最强的菌株。
2.MLST结果显示：30株临床菌中有21株为ST2型，属于CC2；高毒力菌株中5株属于ST2。
3.以高毒力菌株SJZ24建立鲍曼不动杆菌肺炎模型，SJZ24梯度剂量攻毒结果显示5×107CFU为最低100%致死剂量，小鼠感染该剂量4小时到24小时后，肺细菌定植维持在8log10CFU，血液和其他器官的定植有所增加。感染后小鼠肺组织损伤严重，细胞因子分泌增加，中性粒细胞浸润显著增加（P＜0.05）。致死性小鼠肺炎模型建立成功。
4.不同基因型临床株制备IWC，免疫后攻毒自身菌株，结果显示临床株IWC疫苗免疫组的小鼠生存率均显著高于未免疫组（P＜0.05），表明临床株建立的小鼠肺炎模型可用于鲍曼不动杆菌疫苗评价。
第二部分：肺泡巨噬细胞在鲍曼不动杆菌疫苗快速免疫保护中的功能研究
1.B-NDG小鼠中IWC免疫组生存率仍可达60%，提示T、B及NK细胞以外的天然免疫细胞在IWC疫苗快速保护中发挥重要作用。
2.过继IWC免疫AMs的小鼠感染24小时后的临床评分和细菌定植量都显著低于过继未免疫AMs组和未过继阴性对照组（P＜0.05），表明AMs在IWC疫苗介导的免疫保护中具有重要作用。
3.IWC免疫小鼠7天后，IWC免疫组的AMs中TNF-α、IL-6和IL-1β转录水平显著高于未免疫对照组（P＜0.05）。在AMs离体和纯体外培养模型中，用IWC再刺激2小时后，IWC免疫组AMs分泌TNF-α的水平均显著高于未免疫组（P＜0.05）。表明IWC免疫后AMs保持着细胞因子更高的转录水平，当受到再次刺激时可产生更高水平的细胞因子，提示IWC可诱导记忆性AMs形成。
4.注射TNF-α抗体的IWC免疫组小鼠攻毒后生存率显著低于未给抗体的IWC免疫组（P＜0.05），说明AMs可能通过分泌TNF-α在IWC疫苗快速保护中发挥重要作用。
5.IWC免疫7天后的AMs与未免疫AMs相比，其吞噬杀菌相关基因CYBB、CAMP和S100A8的转录水平都显著增加（P＜0.05）。流式结果显示，IWC免疫再攻毒1小时和2小时后，IWC免疫组与未免疫组相比，AMs吞噬GFP细菌能力明显增加。表明IWC免疫后的AMs能够在攻毒后表现出更强的吞噬细菌的能力，从而发挥免疫保护作用。
第三部分：鲍曼不动杆菌疫苗免疫后记忆性肺泡巨噬细胞亚群特征研究
1.IWC免疫后，BALF中主要有一群CD11C+CD11B+的细胞明显增加并可长期存留，说明IWC疫苗诱导了一群新的AMs产生，这可能与AMs天然免疫记忆有关。
2.肺组织scRNA-seq结果显示，所有细胞被分为41个亚群。其中单核巨噬细胞的数目和比例在IWC免疫7天时明显高于对照组。
3.将scRNA-seq结果中单核巨噬细胞再进行聚类分析获得16个细胞亚群，拟时轨迹分析显示其主要分为三个State。IWC免疫7天组与对照组相比，具有一个独特的亚群Cluster7。GO和KEGG功能富集分析显示，Cluster7可能比其他亚群具有更强的细胞趋化、吞噬杀菌、炎症因子应答和炎症信号转导能力，其mTOR信号通路也显著上调。
4.Real-time PCR验证了scRNA-seq结果中，Cluster7的特征基因Gpnmb，Anpep，Syngr1和Mmp14在IWC免疫组AMs的表达显著高于未免疫对照组（P＜0.01）。
第四部分：mTOR通路在肺泡巨噬细胞介导的鲍曼不动杆菌IWC疫苗免疫保护中的作用研究
1.IWC免疫7天后与未免疫组相比，mTOR通路相关蛋白的表达和磷酸化显著增加（P＜0.05），说明mTOR信号可以被IWC疫苗激活并在免疫7天后的AMs中仍然维持较高水平。
2.给药雷帕霉素抑制IWC免疫阶段mTOR通路的小鼠生存率显著低于未给药的IWC免疫阳性对照组（P＜0.05）。IWC免疫攻毒后24小时，给药雷帕霉素组的细菌定植量、病理损伤程度、细胞因子表达水平显著高于未给药组（P＜0.05）。表明mTOR信号在IWC疫苗介导的快速保护中有重要作用。
研究结论：
1.利用高毒力鲍曼不动杆菌临床株建立的小鼠致死性肺炎模型可用于评价IWC疫苗快速保护效应的普遍性和广泛性。
2.肺泡巨噬细胞可被鲍曼不动杆菌IWC疫苗诱导产生记忆性，并在其快速免疫保护效应中发挥重要作用。
3.鲍曼不动杆菌IWC疫苗免疫可诱导小鼠记忆性肺泡巨噬细胞新亚群的出现。
4.mTOR通路可能在肺泡巨噬细胞介导的鲍曼不动杆菌IWC疫苗快速保护效应中起重要作用。
研究意义：
本研究证实了AMs可被IWC疫苗驯化产生免疫记忆，并呈现独特的AMs亚群；记忆性AMs在疫苗快速保护中有重要作用；初步阐明了mTOR通路在AMs介导的疫苗快速保护中的作用。这些结果为研发快速起效疫苗提供了理论基础，同时丰富了天然免疫记忆的理论认识。
2017年，WHO发布一项报告列出严重威胁人类健康的12种耐药细菌，其中鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）位列“榜首”。鲍曼不动杆菌感染人群主要为住院患者，尤其是重症病人，最主要的感染类型为肺炎。多重耐药鲍曼不动杆菌呈世界性流行，使其临床治疗面临严峻挑战。疫苗可从源头上控制耐药细菌的感染与传播，是一种经济有效的防治手段。鲍曼不动杆菌疫苗接种的目标人群主要为住院病人，疫苗接种时间窗口要求很短，希望在接种后3至7天快速起效，尽早产生免疫保护效果。
本课题组前期研究发现，用鲍曼不动杆菌灭活全菌（Invactivated whole cell,IWC）疫苗单次滴鼻免疫小鼠可快速对致死剂量鲍曼不动杆菌攻毒起到100%的保护效果，IWC疫苗的这种快速保护效应在T、B细胞缺陷的Rag1-/-小鼠中同样存在，且宿主应答动力学研究显示疫苗免疫7天后攻毒引发了记忆性应答，提示IWC疫苗的快速免疫保护效应依赖于天然免疫记忆。天然免疫记忆是指天然免疫细胞可在初次免疫暴露后被代谢和表观重编程而储存免疫记忆，再次接受刺激时可呈现增强的宿主防御反应。
mTOR-HIF-1α信号通路可调控多种代谢途径，介导表观遗传重编程，从而诱导天然免疫记忆形成。肺泡巨噬细胞（Alveolar macrophages，AMs）是机体抵御外来病原侵袭肺脏的第一道防线，AMs更新缓慢且能自我维持，为记忆性的形成和维持创造了有利条件。因此推测鲍曼不动杆菌IWC免疫可能驯化AMs形成免疫记忆，在疫苗快速保护中发挥重要作用。然而巨噬细胞具有强异质性，介导单核巨噬细胞免疫记忆的细胞亚群特征尚不清楚，本研究运用单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术尝试解析IWC疫苗免疫后记忆性AMs亚群的特征，并验证其在疫苗保护中的功能，为鲍曼不动杆菌疫苗快速起效提供理论基础。
研究目的：
1.建立小鼠致死性肺炎模型用于疫苗保护性评价。
2.明确肺泡巨噬细胞在鲍曼不动杆菌IWC疫苗快速保护中的作用。
3.初步鉴定疫苗免疫后记忆性肺泡巨噬细胞亚群及其特征。
4.探索mTOR通路在肺泡巨噬细胞介导的鲍曼不动杆菌IWC疫苗快速保护中的作用。
研究方法：
1.分别用30株鲍曼不动杆菌临床分离株对小鼠进行气管插管感染，观察小鼠死亡率初步鉴定其毒力。用MLST方法鉴定临床株的序列型（ST），筛选具有代表性基因型的鲍曼不动杆菌。用高毒力临床株感染小鼠，检测生存率、细菌定植量、组织病理，Real-time PCR检测细胞因子，流式检测BALF炎症细胞浸润，建立小鼠肺炎模型。分别用不同ST型临床株制备IWC，免疫小鼠7天后攻毒，观察生存率。
2.检测B-NDG小鼠IWC单次滴鼻免疫攻毒后生存率，确认天然免疫细胞在IWC疫苗快速保护中的作用。将IWC免疫7天后的小鼠CD11C+AMs用磁珠分选并过继到受体小鼠肺部后攻毒，测定攻毒24小时后的小鼠临床评分和细菌定植量。分别建立体内及体外IWC驯化AMs记忆模型，Real-time PCR检测疫苗免疫7天后AMs细胞因子表达，ELISA检测IWC再刺激2小时后的TNF-α水平。IWC免疫小鼠腹腔注射TNF-α抗体后攻毒，观察生存率。Real-time PCR检测IWC免疫7天后AMs中吞噬杀菌相关标志基因的表达水平；分别用流式检测IWC免疫后攻毒1小时、2小时的AMs吞噬GFP鲍曼不动杆菌的能力。
3.流式检测IWC单次滴鼻免疫0、7、14、30天时，小鼠BALF中AMs的动态变化。对IWC免疫7天后和未免疫小鼠的肺组织进行单细胞转录组测序，对肺组织细胞进行聚类分群，统计免疫后肺组织细胞亚群数目和比例的变化，分析IWC免疫对小鼠肺部细胞的影响。进一步对其中的单核巨噬细胞进行分群定义以及拟时轨迹、细胞亚群特征表达基因分析。Real-time PCR验证scRNA-seq结果中AMs亚群的特征性表达基因。
4.IWC免疫7天后，分别用WB、Real-time PCR、流式检测肺组织和AMs中的mTOR通路的激活情况。在IWC免疫阶段腹腔注射雷帕霉素抑制mTOR通路，观察小鼠免疫攻毒后生存率；检测攻毒24小时后肺组织和血中的细菌定植量，以及肺组织病理；ELISA检测肺和血中的细胞因子表达水平。
研究结果：
第一部分：鲍曼不动杆菌临床菌株分离鉴定及肺炎模型的建立
1.30株临床菌中有23株可引起小鼠死亡，其中6株可引起100%致死，而SJZ24是其中毒力最强的菌株。
2.MLST结果显示：30株临床菌中有21株为ST2型，属于CC2；高毒力菌株中5株属于ST2。
3.以高毒力菌株SJZ24建立鲍曼不动杆菌肺炎模型，SJZ24梯度剂量攻毒结果显示5×107CFU为最低100%致死剂量，小鼠感染该剂量4小时到24小时后，肺细菌定植维持在8log10CFU，血液和其他器官的定植有所增加。感染后小鼠肺组织损伤严重，细胞因子分泌增加，中性粒细胞浸润显著增加（P＜0.05）。致死性小鼠肺炎模型建立成功。
4.不同基因型临床株制备IWC，免疫后攻毒自身菌株，结果显示临床株IWC疫苗免疫组的小鼠生存率均显著高于未免疫组（P＜0.05），表明临床株建立的小鼠肺炎模型可用于鲍曼不动杆菌疫苗评价。
第二部分：肺泡巨噬细胞在鲍曼不动杆菌疫苗快速免疫保护中的功能研究
1.B-NDG小鼠中IWC免疫组生存率仍可达60%，提示T、B及NK细胞以外的天然免疫细胞在IWC疫苗快速保护中发挥重要作用。
2.过继IWC免疫AMs的小鼠感染24小时后的临床评分和细菌定植量都显著低于过继未免疫AMs组和未过继阴性对照组（P＜0.05），表明AMs在IWC疫苗介导的免疫保护中具有重要作用。
3.IWC免疫小鼠7天后，IWC免疫组的AMs中TNF-α、IL-6和IL-1β转录水平显著高于未免疫对照组（P＜0.05）。在AMs离体和纯体外培养模型中，用IWC再刺激2小时后，IWC免疫组AMs分泌TNF-α的水平均显著高于未免疫组（P＜0.05）。表明IWC免疫后AMs保持着细胞因子更高的转录水平，当受到再次刺激时可产生更高水平的细胞因子，提示IWC可诱导记忆性AMs形成。
4.注射TNF-α抗体的IWC免疫组小鼠攻毒后生存率显著低于未给抗体的IWC免疫组（P＜0.05），说明AMs可能通过分泌TNF-α在IWC疫苗快速保护中发挥重要作用。
5.IWC免疫7天后的AMs与未免疫AMs相比，其吞噬杀菌相关基因CYBB、CAMP和S100A8的转录水平都显著增加（P＜0.05）。流式结果显示，IWC免疫再攻毒1小时和2小时后，IWC免疫组与未免疫组相比，AMs吞噬GFP细菌能力明显增加。表明IWC免疫后的AMs能够在攻毒后表现出更强的吞噬细菌的能力，从而发挥免疫保护作用。
第三部分：鲍曼不动杆菌疫苗免疫后记忆性肺泡巨噬细胞亚群特征研究
1.IWC免疫后，BALF中主要有一群CD11C+CD11B+的细胞明显增加并可长期存留，说明IWC疫苗诱导了一群新的AMs产生，这可能与AMs天然免疫记忆有关。
2.肺组织scRNA-seq结果显示，所有细胞被分为41个亚群。其中单核巨噬细胞的数目和比例在IWC免疫7天时明显高于对照组。
3.将scRNA-seq结果中单核巨噬细胞再进行聚类分析获得16个细胞亚群，拟时轨迹分析显示其主要分为三个State。IWC免疫7天组与对照组相比，具有一个独特的亚群Cluster7。GO和KEGG功能富集分析显示，Cluster7可能比其他亚群具有更强的细胞趋化、吞噬杀菌、炎症因子应答和炎症信号转导能力，其mTOR信号通路也显著上调。
4.Real-time PCR验证了scRNA-seq结果中，Cluster7的特征基因Gpnmb，Anpep，Syngr1和Mmp14在IWC免疫组AMs的表达显著高于未免疫对照组（P＜0.01）。
第四部分：mTOR通路在肺泡巨噬细胞介导的鲍曼不动杆菌IWC疫苗免疫保护中的作用研究
1.IWC免疫7天后与未免疫组相比，mTOR通路相关蛋白的表达和磷酸化显著增加（P＜0.05），说明mTOR信号可以被IWC疫苗激活并在免疫7天后的AMs中仍然维持较高水平。
2.给药雷帕霉素抑制IWC免疫阶段mTOR通路的小鼠生存率显著低于未给药的IWC免疫阳性对照组（P＜0.05）。IWC免疫攻毒后24小时，给药雷帕霉素组的细菌定植量、病理损伤程度、细胞因子表达水平显著高于未给药组（P＜0.05）。表明mTOR信号在IWC疫苗介导的快速保护中有重要作用。
研究结论：
1.利用高毒力鲍曼不动杆菌临床株建立的小鼠致死性肺炎模型可用于评价IWC疫苗快速保护效应的普遍性和广泛性。
2.肺泡巨噬细胞可被鲍曼不动杆菌IWC疫苗诱导产生记忆性，并在其快速免疫保护效应中发挥重要作用。
3.鲍曼不动杆菌IWC疫苗免疫可诱导小鼠记忆性肺泡巨噬细胞新亚群的出现。
4.mTOR通路可能在肺泡巨噬细胞介导的鲍曼不动杆菌IWC疫苗快速保护效应中起重要作用。
研究意义：
本研究证实了AMs可被IWC疫苗驯化产生免疫记忆，并呈现独特的AMs亚群；记忆性AMs在疫苗快速保护中有重要作用；初步阐明了mTOR通路在AMs介导的疫苗快速保护中的作用。这些结果为研发快速起效疫苗提供了理论基础，同时丰富了天然免疫记忆的理论认识。