维甲酸诱导小型猪牙周膜干细胞的体外成骨实验研究

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目的:分离、培养、鉴定小型猪牙周膜干细胞(Periodontal Ligament Stem Cells,PDLSCs),研究其生物学特性,观察维甲酸(Retinoic Acid,RA)对小型猪PDLSCs成骨作用的影响,与传统诱导剂地塞米松(Dexamethasone,DEX)成骨作用进行对比,以期为临床利用组织工程学原理修复牙周组织缺损及其他骨缺损提供新思路和动物实验理论依据。  方法:采用组织块法获得小型猪PDLCs,有限稀释法纯化小型猪PDLSCs,免疫荧光法检测STRO-1、免疫细胞化学法检测波形蛋白、角蛋白鉴定小型猪PDLSCs。测定绘制小型猪PDLSCs增殖曲线,检测小型猪PDLSCs克隆形成率。使用RA对第三代小型猪PDLSCs进行成骨诱导,14天后行ALP染色,诱导21天后,茜素红、Von kossa染色检测矿化结节,免疫细胞化学方法检测成骨相关标记物OPN、ONC、ColI、ColⅢ的表达,RT-PCR检测ALP、OPN、ONC、ColI基因表达。使用DEX、RA诱导PDLSCs,14天后对比各组细胞ALP活性。Real-time PCR定量分析DEX、RA诱导PDLSCs第21天ALP、OPN、OCN、ColI基因表达情况。  结果:小型猪牙周膜干细胞STRO-1,波形蛋白阳性表达,角蛋白阴性表达,克隆形成率为2.8%,RA诱导14天后,ALP染色阳性,诱导21天后茜素红、Von kossa染色阳性,免疫细胞化学法检测OPN、OCN、ColI阳性表达,ColⅢ阴性表达。ALP活性检测显示,小型猪 PDLSCs诱导至第14天 RA组 ALP活性高于 DEX组(P=0.000)。Real-time PCR分析成骨相关基因表达结果显示,RA诱导组细胞较DEX组明显上调ALP、OPN、OCN基因表达(P<0.05);ALP、OCN基因表达与RA浓度呈剂量依赖关系;DEX10nM组ColI基因表达高于RA组(P=0.043)。  结论:小型猪PDLSCs能够被RA诱导向成骨样细胞分化。RA诱导小型猪PDLSCs的成骨能力强于DEX。
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