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乙型脑炎（Japanese encephalitis，JE）是一种由乙型脑炎病毒（JEV）引起的中枢神经系统急性人畜共患传染病。全球每年报告的发病人数都在16000例以上，死亡约5000人，病死率平均为30％，被世界动物卫生组织列为B类传染病，成为严重的公共卫生问题。
马属动物是JEV的感染宿主之一，大多数动物感染后发展为非显性感染，但马被该病毒感染后可导致严重的脑炎，引起精神沉郁、呆立、消瘦及死亡现象，给养马及赛马业造成巨大经济损失。E蛋白是病毒表面最重要的结构蛋白，可形成的表面抗原决定簇，具有血凝活性和中和活性，能和血凝抑制抗体结合，刺激机体产生中和抗体，保护机体免受病毒攻击，是基因工程诊断抗原的重要靶蛋白。因此，以原核表达的E蛋白为包被抗原建立JEV间接ELISA诊断方法，对乙脑快速、准确诊断，具有重要意义。
本实验根据GenBank（AF315119.1）公布的JEVSA14-14-2株E蛋白基因序列设计一对表达引物，提取病毒RNA经反转录和RT-PCR扩增获得E蛋白编码基因片段，获得约1500bp目的片段，与GenBank上的序列同源性为100％，无碱基突变、插入或缺失现象发生。将该片段通过酶切插入表达载体pET30α（+），转化表达大肠杆菌感受态BL21（DE3），通过大肠杆菌表达系统，经IPTG诱导蛋白原核表达，表达产物经SDS-PAGE电泳分析显示，目的E蛋白获得了表达，表达产物分子量约为60KD，与预期结果相符。重组蛋白产物经纯化后，Westernblot实验检测蛋白的活性，Westernblot结果显示该蛋白可与JEV阳性血清结合，具有免疫反应性，可以发展成为间接ELISA的包被抗原。
蛋白经纯化后，用E蛋白与JEV全病毒分别免疫12周龄的长白兔，经3次免疫后，血清检测抗体效价，E蛋白免疫制备的多克隆血清抗体为1:1600。经JEV全病毒免疫多克隆血清为1:3400，说明纯化后的蛋白，保持免疫原性，此纯化系统适于E蛋白的纯化。
国内大部分JEV的研究主要对象是人和猪，并未见对于马感染诊断的方法报道。经查找，目前我国还没有针对马乙型脑炎的ELSIA检测试剂盒，世界上也只有美国、西班牙等少数公司生产，且价格昂贵，不适于大批量的检测。因此实验室以表达的E蛋白为包被抗原，经过ELISA条件摸索，在确定了最佳包被条件后，采用正交试验设计的方法摸索了抗原、一抗和二抗稀释度，以及作用时间和显色时间，初步建立了间接ELISA诊断方法。建立的间接ELISA诊断方法特异性和灵敏性较好，不与H3N8亚型马流感病毒（EIV）阳性血清、马动脉炎病毒（EAV）阳性血清、马鼻肺炎病毒（EHV）阳性血清、马传染性贫血病毒（EIAV）标准阳性血清结合作用，OD490nm结果测定，OD值均小于0.2，均为阴性。
用建立的方法对广州、深圳、武汉、黑龙江采集的1042份马血清进行应用检测，经检测其中437份为阳性，抽取部分血清样本用全病毒检测进行比较，结果二者符合率为93％，只有部分蛋白检测为阴性但全病毒为可疑值。初步进行了马脑炎血清学调查，认为马脑炎在我国马属动物流行率较高。诊断方法可用于JEV的应用检测，为马乙型脑炎间接ELISA诊断试剂盒的研究奠定基础。