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目的：将设计的针对人血管内皮生长因子(VEGF)短发夹RNA与质粒载体连接，转染体外培养视网膜色素上皮(RPE)细胞，观察其对RPE细胞VEGF表达的影响及其转染效率和对细胞的毒性。构建含有表达人VEGF短发夹RNA(shRNA)，的逆转录病毒载体并转染RPE细胞，观察其对RPE细胞VEGF表达的影响及其对细胞的毒性。
方法：(1)采用Hu氏酶辅助的显微分离法分离人眼RPE细胞，并进行免疫组化鉴定。氯化钴化学缺氧法模拟缺氧环境。免疫组化和Westernblot检测乏氧诱导后RPE细胞中VEGF和β-actin的表达水平。(2)将设计的针对人VEGF特异性shRNAs(V1、V2、V3)及非特异性shRNA(V4)，与质粒载体连接后分别转染RPE细胞，据此进行分组；并设非转染组作对照组。诱导各组细胞乏氧，用RT-PCR和Westernblot方法检测其VEGF表达。用倒置荧光显微镜及流式细胞仪观察其转染效率；用MTT法观察其对细胞的毒性。(3)用BamHⅠ和HindⅢ双酶切抑制作用强的质粒，回收纯化酶切下小片段连接到线性化的逆转录病毒载体的两个相同酶切位点之间，取连接产物转化DH5α细胞，小量扩增并酶切和测序鉴定，转染包装细胞GP2-293细胞，并嘌呤霉素筛选后进行病毒滴度测定。取病毒液转染RPE细胞并诱导乏氧并嘌呤霉素筛选后用RT-PCR和Westernblot方法检测RPE细胞VEGF的表达水平。用MTT法检测转基因RPE细胞生物活性。结果：(1)分离获得的RPE细胞，免疫组化染色均为阳性，无阴性染色细胞。低氧条件下，RPE细胞VEGF的表达显著增加。(2)RT-PCR和Westernblot检测结果显示，转染组(V1、V2、V3组)的RPE细胞VEGF表达量明显低于V4及非转染组。荧光显微镜观察质粒转染RPE细胞24小时后GFP开始表达，48小时表达明显增强。流式细胞仪检测质粒转染RPE细胞48小时后其转染效率为43.9％。MTT法测定质粒转染后细胞活性的OD值与非转染组相比明显降低，有统计学意义(P=0.004)。(3)shRNA与病毒载体的连接产物经酶切和测序鉴定后结果正确。扩增后转染GP2-293细胞进行病毒包装，并嘌呤霉素筛选后测病毒滴度为4x104cfu/ml。病毒转染RPE细胞后RT-PCR和Westernblot检测结果显示，病毒转染组的RPE细胞VEGF表达量明显减少。抑制率明显高于质粒载体转染。MTT法显示转染逆转录病毒后，对细胞活性无明显影响(P=0.052，t=2.034)。
结论：(1)用酶辅助显微分离法，获得了RPE细胞的高效纯化培养；缺氧可明显增加RPE细胞中VEGF表达。(2)针对人VEGF的特异性shRNA连接的质粒载体可以有效地转染RPE细胞并明显降低人RPE细胞VEGF的表达。但质粒转染对细胞有明显的毒性。(3)成功构建了表达人VEGF短发夹RNA的逆转录病毒载体，并且转染RPE细胞后，能降低其VEGF的表达，而且转染后对RPE细胞无明显毒性。提示RNA干扰可能基因治疗新生血管性眼病的有效新途径。