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神经元本身因缺血引起损伤以及缺血后再灌注导致神经元损伤是缺血性脑损伤的两大原因，二者均伴有神经元胞浆内钙离子浓度增高，胞浆内钙离子变化的重要意义倍受研究者的关注，它可能是各种损伤因素作用的结果，也可能是造成脑缺血损伤的各种因素最后作用的共同通路，即各种因素最后是通过增高的钙离子来产生神经毒性。尽管目前认为神经元胞浆内钙离子升高不是缺血性脑损伤的必要条件，但在缺血条件下，钙离子可能是神经元缺血性级联损伤的主要激活因子之一。本实验利用共聚焦荧光显微镜、透射电镜、荧光显微镜、倒置显微镜等实验仪器，采用免疫荧光法、脱氧核糖核苷酸末端酶介导的缺口末端标记法(TUEL法)、透射电镜法，并借助钙通道拮抗剂-氟桂利嗪，作为干预因素，观察体外神经元类缺血处理后以及类缺血后再灌注不同时间胞浆内钙离子变化、神经元的细胞活性变化、神经元的超微结构变化，以探讨缺血性神经元损伤时钙离子的变化、神经元凋亡的发生情况及意义。试图为缺血性脑损伤的研究提供简便的模型，为缺血性脑损伤的发生机制提供实验依据。 本次实验采用神经元原代培养法，体外建立神经元缺血模型 第四军医大学硕士学位论文 及缺血再灌注模型，将培养成熟的神经元经鉴定后分为正常对照 组、缺血再灌注组、氟桂利喷治疗组、，观察各组神经元胞浆内钙 离子变化、细胞活性变化、超微结构变化、凋亡的发生情况。本 次实验所得结果如下： （二）本实验所培养的神经元纯度为 83．4土 2刀％，达到神经元 的纯度要求（＞80％），满足后续实验要求。 （2）神经元于缺血再灌注后30min、lh、Zh检测的胞浆钙离 子浓度及MTT法所测A值与氟桂利嗓组相比，前者钙离子浓度明 显高于后者（P＜0．of），前者的 A值的明显低于后者（P＜0．of）。 （3）神经元于缺血再灌注后30min、lh、Zh，3h，透射电镜下 观察，神经元的损伤程度逐渐加重，早期表现为细胞的肿胀，线 粒体、高尔基体、内质网的肿胀，突起消失，微绒毛消失，细胞 边缘平直，继而出现细胞的空泡变性，核染色质浓缩边集，吞噬 溶酶体的出现，凋亡小体出现，晚期出现大量的裸核、核碎裂、 核溶解。氟桂利嗓处理组损伤相应较轻。 ④ 神经元于缺血再灌注后30min、且卜、Zh，凋亡细胞数不 断增加，Zh为高峰，3h开始下降，倒置显微镜下看，胞体肿胀， 圆形或椭圆形，突起变短或消失，氟桂利嗓处理后，相应时间凋 亡细胞数明显降低（KO．of）。 本次实验结论如下： ＊）体外神经元类缺血及缺血再灌注处理后，神经元发生的 病理变化与体内相似，是研究缺血性脑损伤的理想模型之一。 （2）神经元于缺血再灌注后30min、lh、Zh，胞浆内钙离子 浓度不断增高，氟桂利嚎对相应时间的钙离子浓度增高有明显抑 制作用，随再灌注时间延长，细胞活性降低，氟桂利嘻对再灌注 －4－ 第四军医大学硕士学位论文神经元损伤有一定保护作用。 m神经元于缺血再灌注后30min、lh、Zh，3h，损伤不断加重，表现为细胞超微结构的变化：神经元细胞的变性，凋亡，坏死。氟桂利噎对再灌注神经元超微结构变化有一定的保护作用。 （4） 神经元于缺血再灌注后30min、lh、Zh，凋亡细胞数不断增加，其中Zh为神经元发生凋亡的高峰，氟桂利噎对再灌注神经元凋亡的发生有明显抑制作用。