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目的狂犬病是一个重要的全球性公共卫生问题。我国狂犬病死亡人数高居世界第二位，位居我国重点传染病的榜首。近年来随着养犬数量的增加我国狂犬病正形成第5次流行高峰，成为严重危害我国公共卫生的重大问题。目前尚无有效治疗狂犬病的方法，其控制主要依赖犬只免疫群的建立。因此研制对犬只进行免疫接种和免疫监测用的高效疫苗和诊断试剂具有重要意义。本文构建含狂犬病毒(RV)ERA株糖蛋白(GP)和核蛋白(NP)基因的重组杆状病毒，在昆虫细胞表达了ERA核蛋白，来探讨研制新一代狂犬病疫苗及诊断试剂的途径。
方法第1步：用RV兽用疫苗ERA株感染鼠，以RT-PCR扩增鼠脑组织中的RVNP和GP基因，再将目的基因片断分别克隆到TA克隆载体PCR(R)2.1中，以蓝白斑筛选及质粒DNA小量提取后，以PCR扩增、序列测定等方法筛选鉴定，制备TA克隆质粒；第2步：阳性TA克隆质粒和Bac-to-Bac杆状病毒表达系统转座载体pFastBacTM1经KpnI、NotI酶切、回收、连接等步骤转化OneShortTMTOP10感受态细胞，仍以蓝白斑筛选等方法鉴定，制备重组转座质粒；第3步：将阳性重组转座质粒分别转化到含有穿梭载体Bacmid和辅助质粒(helpplasmid)的感受态细胞DH10BacTME.coli中，经三抗培基、琼脂糖凝胶电泳、PCR扩增、等方法筛选鉴定，制备重组穿梭质粒；第4步：将含有RVERANP基因的重组穿梭质粒感染昆虫细胞Sf9，根据空斑试验结果收集病毒液，用SDS-PAGE、Westernblot、DIFA和ELASA对细胞表达产物进行检测和分析。
结果用蓝白斑筛选出的TA克隆质粒，经质粒DNA小量提取后经PCR扩增、序列测定证实含RVERANP和GP基因，命名为PCR(R)2.1RabERAN和PCR(R)2.1RabERAG；同法筛选出的重组转座质粒，经鉴定证实含RVERANP和GP基因，命名为pFastRabERAN和pFastRabERAG；用三抗培基筛选出的重组穿梭质粒(重组Bacmid质粒)，经多种方法鉴定含RVERANP和GP基因，命名为rBacmidRabERAN和rBacmidRabERAG；将重组穿梭质粒rBacmidRabERAN和rBacmidRabERAG转染昆虫细胞Sf9后，收获和扩增含NP和GP基因的重组病毒。并在昆虫细胞上表达了重组核蛋白。用SDS-PAGE、Westernblot、IFA和ELASA均从培养液中检测到RVERANP基因的表达产物。
结论成功构建了含有ERANP和GP基因的重组杆状病毒，并在昆虫细胞中表达了ERA的核蛋白。