论文部分内容阅读
一、石刁柏转录因子DREB基因的克隆及其功能研究
石刁柏(Asparagus officinalis L．)，百合科天门冬属多年生草本植物，具有丰富的营养和一定的药用价值，被广泛种植。但是，盐害仍是限制其产业化的重要因素。本论文开展了石刁柏抗逆转录因子基因的分离以及功能分析等工作，取得如下结果：
采用RACE-PCR克隆方法，从石刁柏中分离到一个干旱应答元件结合蛋白(DREB)类转录因子基因，将其命名为AoDREB1。该基因cDNA序列全长为1076bp，编码240个氨基酸。序列比对表明，AoDREB1与已知DREB的AP2/EREBP结构域处具有很高的同源性，可归类于DREB亚家族的A6小家族。酵母单杂交实验显示，AoDREB1能够特异地识别DRE元件，并能激活下游报告基因的表达，证明其具有DREB转录因子的两大功能结构域，即DNA结合域和转录激活域。
Northern杂交分析表明，该基因在转录水平受高盐和渗透胁迫的诱导，但不受低温胁迫和ABA的诱导。构建植物过量表达双元载体p3301-121-AoDREB1，转化拟南芥，得到T2代转基因植株。抗性分析和下游功能基因表达检测结果表明：转AoDREB1基因拟南芥植株与野生型相比，其耐受高盐、渗透胁迫和干旱的能力均得到明显提高，并且DREB调控的逆境胁迫诱导表达下游标志基因RD29A和COR15A在正常生长的转基因植株中表达，说明AoDREB1基因具有启动下游抗性基因、提高植物对环境胁迫抵御能力的功能。
二、水稻类受体蛋白RLP基因的克隆及功能分析
水稻是世界三大粮食作物之一，为禾本科植物研究的模式材料。全球每年因虫害和倒伏伤害给粮食生产带来巨大损失。本实验室在进行水稻幼苗叶鞘伤害蛋白质组学研究时发现，机械伤害24小时后丰度表达的一个蛋白经鉴定是DUF26类的受体蛋白。为了深入研究这个蛋白的功能，开展了该基因的分离和功能研究：
采用RACE-PCR克隆方法，从水稻中分离到一个类受体蛋白基因，命名为OsRLP1。其cDNA全长序列为1015bp，编码258个氨基酸。基因组学和生物信息学分析表明，OsRLPI位于第4号染色体，只有一个拷贝，没有内含子，含有一个信号肽和2个C-X8-C-X2-C基序即半胱氨酸富集区(Cys-rich repeat，CRR)。
采用RT-PCR方法分析OsRLP1在水稻中表达模式表明，该基因在正常生长幼苗的根、叶鞘和叶片中没有表达，但受机械伤害、高盐、渗透胁迫、茉莉酸甲酯的诱导，而不受低温(4℃)和脱落酸的诱导。选取叶鞘部位对机械伤害、高盐和渗透胁迫进行Western杂交分析，其结果与RT-PCR的结果一致，说明OsRLP1基因与这些胁迫应答途径相关。
为了进一步研究OsRLP1基因的功能，构建了该基因的植物过表达载体p1301-OsRLP1和启动子融合GUS的载体p1301-Promoter，以开展转基因水稻功能验证工作。