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研究目的：
初步探讨非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)与肝纤维化、肝硬化、肝细胞癌(HCC)之间的关系,并为解释由NAFLD进展至肝纤维化、肝硬化、HCC的可能机制,为NAFLD相关HCC的早期诊断提供实验性依据。
研究方法：
(1)选用高胆固醇高脂饲料喂养小鼠,逐步建立非酒精性单纯性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及NASH相关肝纤维化的动物模型:选用雄性昆明种小鼠60只,随机分为基础饲料组(对照组,C组)和高胆固醇高脂饲料组(模型组,F组),每组30只,各组分别随机设立4、8、12、16、24周5个时相点,各组每个时相点6只小鼠,分别于不同时相点处死各组小鼠,获取全血标本,收集肝脏标本,用于相关指标的检测。
(2)动态观察各组:①全自动生化分析仪检测小鼠血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、甲胎蛋白(AFP)含量;②Elisa法检测小鼠血清瘦素(Leptin)、胰岛素样生长因子结合蛋白-2(IGFBP-2)、异常凝血酶原(DCP)的含量;③分光光度法检测小鼠肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)的含量;④镜下观察小鼠HE染色肝脏组织病理情况;⑤免疫组化SP法测定小鼠肝组织中环氧合酶-2(COX-2)、细胞角蛋白18(CK-18)的分布及表达。
研究结果：
(1)小鼠血清肝酶、血脂、肝癌血清标志物的含量:与对照组4周相比,模型组血清AST水平在第16周时明显升高(P＜0.01),24周时稍有下降,但仍高于对照组4周(P＜0.05);模型组血清ALT水平在第8-16周时明显升高(均P＜0.01),24周时稍有下降,但仍高于对照组4周(P＜0.05);模型组血清TC水平在第4-8周时升高(均P＜0.05),12周时明显升高(P＜0.01),16周时稍有降低,但仍高于对照组4周(P＜0.05);模型组血清TG水平在第4周时升高(P＜0.05),8-12周时明显升高(均P＜0.01),16周时稍有降低,但仍高于对照组4周(P＜0.05);模型组血清AFP、DCP水平在第8周时均升高(均P＜0.05),12-24周均明显升高(均P＜0.01)。
(2)小鼠血清Leptin、IGFBP-2的含量:与对照组4周相比,模型组血清Leptin、IGFBP-2水平在第24周时均升高(均P＜0.05)。
(3)小鼠肝组织氧化和抗氧化指标的水平:与对照组4周相比,模型组肝组织SOD活性在第8周时下降(P＜0.05),12-16周时明显下降(均P＜0.01),24周时稍有回升,但仍低于对照组4周(P＜0.05);模型组肝组织MDA水平在第8-16周时明显上升(均P＜0.01),24周时稍有回落,但仍高于对照组4周(P＜0.05)。
(4)小鼠肝组织HE染色结果:对照组4周肝脏无异常发现;模型组4周时肝脏呈现轻度脂肪变性,8周时脂肪变性加重,呈轻中度脂肪变性,12周时部分出现NASH征象,16周时呈中重度脂肪变性,部分出现肝脏纤维组织增生,24周时呈重度脂肪变性,部分肝脏纤维化较前严重,有桥接纤维化。
(5)小鼠肝组织免疫组织化学染色结果:对照组4周、模型组4-12周时肝组织COX-2、CK-18在血管壁均少量表达,染色呈浅棕黄色,模型组16周时两者的阳性表达细胞均开始增多,染色呈散在分布的浅棕黄色,模型组24周时两者的阳性表达细胞数目均增多,程度增强,COX-2阳性细胞主要位于汇管区、肝血窦周围以及纤维间隔;CK-18阳性细胞从汇管区向肝小叶中央区呈减少趋势。
结论：
1.成功地建立了与人类疾病过程相似的NAFL、NASH及NASH相关肝纤维化的动物模型。
2.检测血清Leptin及IGFBP-2,肝组织COX-2及CK-18可能对早期预测NAFLD相关肝纤维化、肝硬化及HCC有一定的帮助。
3.NAFLD是肝纤维化、肝硬化发生的原因之一,有进一步发展为HCC的可能。