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脂肪酶的主要来源是微生物发酵生产,其作为一种重要的工业用酶,广泛应用于医药、能源、精细化工、食品等领域。而生物柴油作为矿物资源的一种替代品,其环保性,可再生性,也日益引起人们的广泛关注。本论文对粗状假丝酵母的诱变、筛选、遗传稳定性以及产酶条件等展开系统的研究；对脂肪酶的提取、分离纯化、酶学性质、修饰、固定化、催化生物柴油的合成及副产物甘油的分离纯化等方面进行较为深入的探讨。
紫外诱变粗状假丝酵母及高产脂肪酶菌株Y19产酶条件的优化。对酵母菌紫外诱变筛选,最佳诱变时期为对数期,即24 h；最适诱变浓度为种子液稀释至10-4；在紫外照射40s后,致死率93.62％。在最佳紫外诱变条件下得到高产脂肪酶菌株Y19,经遗传稳定性测试其产酶活性最高,为10500 U,比出发菌株提高了3倍。同时对Y19产酶条件进行优化,得到最佳发酵条件:蔗糖为碳源、酵母膏为氮源、橄榄油含量1％(v/v)、培养基初始pH7、培养温度30℃、发酵培养34h；每毫升发酵液酶活性为18083 U。
将在最佳反应条件下的发酵液分离纯化提取Y19脂肪酶及酶学性质的研究。分别用30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％饱和度的硫酸铵沉淀,得出50％饱和度硫酸铵沉淀的脂肪酶比活性最高,为5238 U/mg。沉淀后的脂肪酶用蒸馏水复溶解后,经葡聚糖G-75凝胶过柱,纯化倍数1.17,回收率63.68％。最后收集过柱的脂肪酶液冷冻干燥,获得较纯的Y19脂肪酶用于酶学性质的研究:该酶的最适温度35℃；最适pH7.5；Km值103 g/L；在温度30℃、pH7.5的条件下,保温30 min后,酶活性为初始活性的70％,具有较好的稳定性；将脂肪酶溶于pH7的缓冲溶液中,4℃条件下放置24小时,可保持75％的酶活性。
为了提高脂肪酶在转酯化反应中对底物的亲和性及稳定性,对提取后较纯的Y19脂肪酶进行硬脂酸修饰及海藻酸钠固定化。未经过修饰直接固定化的Y19脂肪酶最适温度30℃,最适pH8,Km值75.67 g/L；修饰后固定化Y19脂肪酶的最适温度40℃,最适pH7.5,Km值36.00 g/L。修饰后固定化Y19脂肪酶与未经过修饰直接固定化的Y19脂肪酶相比,Km值降低,表明经过修饰然后固定化的脂肪酶对底物的亲和性有了明显的提高。
采用修饰后固定化Y19脂肪酶催化生物柴油的合成。将温度、油醇摩尔比、修饰后固定化Y19脂肪酶预处理时间和甲醇的加入方式四个因素对生物柴油转化率的影响进行单因子及正交试验测定。最适反应条件:油醇摩尔比1:2、反应温度40℃、修饰后固定化Y19脂肪酶的预处理时间8 h、甲醇分3次等量每隔4小时加入；每克菜籽油最高生成385.04 mg生物柴油。通过正交试验测定,四个因素对生物柴油转化率影响程度大小依次为甲醇的加入方式、修饰后固定化脂肪酶的预处理时间、温度、油醇摩尔比。
本文同时对生物柴油反应的副产物甘油进行了分离纯化。将甘油层常压蒸出甲醇,用1％活性炭、80℃搅拌20 min后过弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂,最后减压蒸馏得到甘油浓度22.14 g/L,得率为41.2％。