小麦富硒耐硒的生理及分子生物学基础研究

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硒是人体必需的14种微量元素之一,具有多种生理功能,缺硒会导致多种疾病的发生。通过日常膳食进行合理的补硒是行之有效的方法之一。小麦是理想的富硒食物,普通小麦(Triticum aestivum L.,AABBDD)是四倍体小麦(Triticum turgidum,BBAA)和节节麦(Aegilops tauschii,DD)天然杂交然后通过染色体自然加倍形成的异源六倍体。前期研究表明节节麦(Aegilops tauschii,DD)比普通小麦(Triticum aestivum L.,AABBDD)和四倍体小麦(Triticum turgidum,BBAA)具有较强的富硒特性。本文以小麦D基因组供体材料节节麦(Ae.tauschii,DD,2n=2x=14)为研究对象,从节节麦AS2407中分离到同型半胱氨酸甲基转移酶基因(Homocysteine S-Methyltransferases gene,HMT)AetHMT1,系统研究了AetHMT1生化特性及该蛋白在大肠杆菌及植物中的生理功能。以硒吸收能力差异大的节节麦(Ae.tauschii)为材料,通过RNA-seq技术挖掘硒代谢响应的关键基因。本研究为富硒小麦新材料的创制及新品种培育提供理论基础和育种元件。  结论如下:  1.从节节麦AS2407中克隆到HMT1基因,命名为AetHMT1,生物信息学分析发现AetHMT1包含一个GGCCR的保守锌链结构,该结构是HMT酶催化活性必须位点。  2.原核表达AetHMT1基因,异源表达蛋白产物与预测的分子大小一致。通过IPTG及低温诱导、分离纯化获得具有活性的AetHMT1,酶活测定表明该酶具有HMT酶的活性,且酶活大小为87.954±0.166U/mg。  3.将转AetHMT1基因的大肠杆菌和普通大肠杆菌菌株在分别含有100μM亚硒酸钠和100μM硒酸钠的M9培养基中培养,发现转AetHMT1基因菌株在100μM亚硒酸钠和100μM硒酸钠胁迫下OD600值均比对照高,表明AetHMT1基因能够提高大肠杆菌的耐硒能力。  4.外源硒处理促进AetHMT1基因在新叶、老叶、茎和根中表达上调。表明AetHMT1基因能够响应外源硒的处理,外源硒可以调节AetHMT1在各器官中的表达。  5.通过农杆菌介导法把AetHMT1基因转入烟草,获得转AetHMT1基因烟草,转AetHMT1基因烟草在硒胁迫处理下发芽率比对照平均高6.11%,抗氧化酶活性高于对照,丙二醛(MDA)含量低于对照。转AetHMT1基因烟草总硒含量高于对照野生型烟草。AetHMT1基因不仅可以提高烟草的抗逆能力,而且能够提高烟草对硒的积累。  6.利用RNA-seq测序技术,对硒吸收差异较大的节节麦AS2407和AS65在硒处理下的基因表达网络进行比较分析,发现与AS65相比,AS2407存在大量的差异表达基因。差异基因富集最多的是代谢过程。通过查找硒吸收相关的代谢途径,挖掘了候选基因,并挑选符合条件的差异基因进行RT-qPCR验证,结果与RNA-seq测序结果一致。
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