人类Grb10基因和hPPB基因的克隆及功能研究

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细胞凋亡是多细胞生物调节机体结构和功能的重要途径。在生理情况下,细胞凋亡可能为默认的途径。细胞通过感受细胞因子和周围环境的的刺激而使细胞脱离凋亡过程。该过程的障碍可能是退行性疾病和肿瘤发生的基本相关因素。 本实验通过酵母双杂交得到与线粒体凋亡途径中重要功能分子him相互作用的蛋白GrblO。GrblO蛋白为生长因子受体结合蛋白,是酪氨酸受体的分子伴侣,参与多种信号转导与调节。其家族保守功能域包括N端的富含脯氨酸的区域,中间GM区的RA结构域和PH结构域,以及C端的SH2结构域。酵母双杂交结果提示,GrblO可能参与bim介导的凋亡信号通路。我们对GrblO进行全长蛋白的基因克隆,GST融合蛋白的表达和纯化,对其与bim进行Pull—down和免疫共沉淀等体内体外结合实验,以及检测细胞凋亡观察GrblO对him功能的影响。Pull—down体外结合实验显示GrblO与him有相互作用。细胞凋亡检测显示GrblO对bim过表达引起的凋亡有抑制作用。 在对AD293和HEK293进行差减杂交实验以探索两者在黏附和凋亡特性的差异时,在AD293的高表达文库里分离得到一段新的cDNA片段。我们从人类胎脑文库克隆得到该基因,全长2745bp,编码的蛋白含518个氨基酸,被预测为磷酸泛酰巯基乙胺结合蛋白一hPPB。该基因定位在2p22.3,包含8个外显子。该cDNA序列编码的蛋白序列含有一个凋亡抑制蛋白5结构域,外皮蛋白重复片断和铜结合辛肽重复片断。RT一PCR分析显示该基因在人类正常组织和癌组织中均广泛表达,但在癌组织中表达量相对较低。该基因在进化过程中高度保守。
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