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1.背景如何延缓衰老是老年医学面临的重大挑战。衰老的自由基理论认为,衰老是细胞成分累积性氧化损伤的结果。线粒体生成的活性氧是随龄累积性氧化损伤的主要原因,衰老与自由基的关系是通过线粒体实现的,由此导致衰老的自由基一线粒体理论的出现。对于心肌线粒体代谢,目前国内外均进行了一些动物实验研究,认为线粒体在生物能量合成、生成氧化产物及细胞死亡调节方面具有关键作用,因此,线粒体一直是几种衰老学说的中心内容。由于对大分子物质氧化损伤的累积,心肌线粒体功能下降可能是衰老导致心脏功能下降的原因。已有研究显示褪黑素能通过清除氧自由基发挥抗氧化、抗衰老作用。但是,对褪黑素对心肌线粒体衰老防治作用的研究,目前国内外很少报道。2.目的建立人工老化动物模型,探讨褪黑素对D-半乳糖致衰老大鼠心肌线粒体功能及完整性的影响以及对线粒体衰老是否具有防治作用,为进一步探索预防衰老的新途径创造条件。3.研究材料和方法3.1褪黑素对D-半乳糖促衰老大鼠心肌能量代谢作用的研究将SD大鼠随机分为:1)对照组(C组):3月龄雌雄大鼠各1 0只,2)致衰老组(D组):雌雄大鼠各1 0只,3)致衰老+褪黑素组(M组):雌雄大鼠各1 0只,4)自然衰老组(N组):24个月雌雄大鼠各10只。致衰老组D-半乳糖125mg/kg/d,皮下注射6周;致衰老+褪黑素组D-半乳糖125mg/kg/d皮下注射6周,加褪黑素10mg/kg/d腹腔内注射6周。对照组每日皮下及腹腔注射等量生理盐水。造模成功后,用高效液相色谱法测定各组大鼠左室心肌ATP、ADP、AMP含量,并计算总腺苷酸量(total adenylic acid number,TAN=ATP+ADP+AMP)。心肌细胞的能量状态用能荷表示,计算公式:能荷(energycharge,EC)=1/2ADP+ATP/TAN。3.2褪黑素对D-半乳糖促衰老大鼠心肌线粒体内外细胞色素C影响的研究动物分组及处理同3.1部分。取各组大鼠左室心肌制作光镜、免疫组化及免疫荧光标本。进行HE染色及细胞色素C、电压依赖性阴离子通道(VDAC)腺苷酸转运体(ANT)、凋亡抑制蛋白Bcl-2、促凋亡Bax免疫组化及免疫荧光染色。同时对上述指标进行Western blot检测,进行半定量分析;并用荧光定量PCR技术检测各组大鼠心肌外膜VDAC、内膜ANT、细胞色素C mRNA基因表达水平变化,并进行定量分析。4、结果4.1褪黑素对D-半乳糖促衰老大鼠心肌能量代谢作用的研究在本组实验中观察了不同处理组大鼠左心室的能量代谢状况。所观察的参数包括AMP、ADP、ATP、TAN、及EC值等。方差分析显示自然衰老组AMP值较其他三组明显升高,而ADP、ATP、TAN及EC值较其他三组明显降低(P＜0.05)(图4);褪黑素处理组(图2)ATP、TAN值较其他组明显升高(P＜0.05),EC亦升高,但与D-gal促衰老组比较无明显差异(P＞0.05)。4.2褪黑素对D-半乳糖促衰老大鼠心肌线粒体内外细胞色素C影响的研究褪黑素处理D-半乳糖促衰老大鼠HE染色结果病理HE染色发现,C组M组同D组N组大鼠相比心肌细胞数量多,细胞形态饱满,细胞间质少,心外膜血管丰富;而D组及N组大鼠心肌细胞数量相对较少,细胞形态欠饱满,细胞间质较多,心外膜血管较少。褪黑素处理D-半乳糖促衰老大鼠线粒体内部分物质免疫组化结果C组、M组ANT同D组、N组相比染色明显增强,组间差异明显(P＜0.05)。VDAC及细胞色素C在C组、M组与D组、N组相比染色明显减弱,组间差异明显(P＜0.05)。Bax染色在各组间无明显差异,心肌外膜染色较中膜增强。免疫荧光显示同样结果。Bcl-2染色弱,在各组间无明显差异。褪黑素处理D-半乳糖促衰老大鼠线粒体内基因表达水平ANT mRNA表达量在D组及N组与C组及M组比较明显增加(P＜0.05)。VDAC mRNA及CYTC mRNA表达量在D组及N组与C组及M组比较明显降低(P＜0.05)。褪黑素处理D-半乳糖促衰老大鼠心肌线粒体内蛋白表达水平实验结果显示,大鼠心肌及线粒体中总蛋白含量在C组最低,而其他三组间无明显差异。M组线粒体内ANT较其他三组增高、而VDAC较其他三组明显降低(P＜0.05)。细胞色素C蛋白表达在线粒体及胞浆中各组间无明显差异,而观察胞浆及线粒体中细胞色素C含量比值发现在D-组及N组与C组及M组比较明显升高(P＜0.05)。Bcl-2在对照组最高(P＜0.05),而其余各组间无明显差异(P＞0.05),Bax蛋白水平在各组间无明显差异(P＞0.05),但Bcl-2与Bax比值发现C组及M组较D组及N组明显增高(P＜0.05)5.结论5.1褪黑素加D-半乳糖处理组大鼠心肌能量代谢较其它组强,线粒体功能可能得到较好保护。5.2 1)褪黑素可能通过升高线粒体内细胞色素C维持ETC,保证线粒体内氧化磷酸化正常进行,保证ATP产量,减少电子漏,减少自由基形成;同时减少细胞色素C从线粒体内向胞浆转移,减少细胞凋亡而保护线粒体功能,从而延缓心肌衰老。2)褪黑素减少细胞色素C自线粒体向胞浆释放可能是通过Bcl-2家族调控实现的。