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研究背景：
苍白密螺旋体(Treponema pallidum, Tp)感染引起的梅毒对人体可造成组织损伤和多器官功能障碍，其早期皮损大大增加了人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)的感染和传播，还可以通过母婴传播威胁下一代健康，已成为严重的公共卫生问题。随着DNA技术的发展，高通量、自动化、易于标准的筛查试验大量出现，酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)和化学发光免疫分析(Chemiluminescent immunoassay, CLIA)广泛应用于人群的筛查和疾病诊断，这些试验采用多种重组蛋白组合作为抗原，敏感性可高达100%，但是特异性尚不够理想。
近年来，国内外较多实验室采用反向筛查方法，即先采用ELISA/CLIA筛查，阳性血清再进行甲苯胺红不加热血清试验(Tolulized red unheated serum test， TRUST)/快速血浆反应素试验(Rapid plasma reagin,RPR)。反向筛查中发现，在梅毒低流行人群中，ELISA/CLIA结果出现了较高的假反应性，不仅给检验工作带来了错误的结果，影响临床诊断，而且会增加患者的心理负担和就医支出，甚至引起医疗纠纷，必须重视。Tp47蛋白作为检测梅毒特异性抗体的主要抗原之一，但有研究报道，Tp47中有一段氨基酸序列与人纤维连接蛋白序列有较高的同源性，这可能是梅毒筛查结果中出现假反应性的原因之一。因此，对目前的诊断用抗原进行优化，去除特异性差的片段，提高检测试剂特异性，将可能成为解决现存在的假反应性问题的重要方案。
目的：
1)通过生物信息学预测梅毒螺旋体B细胞抗原表位，表达优势表位融合片段。为评估优势表位融合蛋白在梅毒血清学诊断中的应用提供物质基础，也为未来获得各类新的优势表位融合蛋白奠定基础。
2)对表位融合片段进行HRP标记并建立双抗原夹心ELISA检测方法，进一步探讨表位融合片段作为抗原在梅毒血清学诊断中解决假反应性问题的可行性，为建立新一代梅毒血清学诊断方法提供依据。
方法：
1)根据梅毒螺旋体Nichols株Tp47蛋白的氨基酸序列，通过生物信息学技术预测其B细胞表位，选取得分数较高的多个片段，利用重叠PCR技术连接优势表位片段获得表位融合片段，构建pET-28b-表位融合片段的表达载体并转化入BL21(DE3)感受态细胞中，IPTG诱导表达后使用亲和层析法纯化，对表达的优势表位融合片段进行质谱分析和免疫印迹鉴定。
2)用过碘酸钠法在低温避光条件下对表位融合片段进行HRP标记，建立双抗原夹心ELISA方法。检测96例Architecti2000梅毒阳性血清标本(1＜S/CO＜10)，以TPPA检测结果为标准，比较优势表位融合片段与Tp47蛋白在梅毒特异性抗体检测中的敏感性和特异性，评估优势表位融合片段的诊断性能。
结果：
1)选择的Tp47蛋白B细胞抗原决定簇的区域分别是81-120aa，160-260aa，300-390aa三个片段。通过重叠PCR扩增成功获得表位融合片段基因，成功构建表达载体pET-28b-表位融合片段，测序结果与GenBank数据库中的序列完全一致，质谱鉴定结果和免疫印迹结果表明成功获得表位融合片段。
2)成功获得HRP标记的表位融合片段。以TPPA结果作为标准，表位融合片段双抗原夹心ELISA的敏感性和特异性为90.32%(56/62)和94.12%(32/34),与TPPA结果的检测符合率为91.67%，检测结果的差异无统计学意义(P＞0.05)。Tp47的双抗原ELISA法检测敏感性和特异性分别为93.55%(58/62)和79.41%(27/34)，与TPPA结果的检测符合率为88.54%，检测结果的差异无统计学意义(P＞0.05)。
结论：
与Tp47蛋白相比，表位融合片段作为抗原的ELISA方法的总符合率增高，特异性明显提高，但敏感性稍显不足。提示通过优化抗原能够提高检测的特异性，可以降低梅毒检测的假反应性，为发展新一代梅毒血清学诊断抗原提供方法。
苍白密螺旋体(Treponema pallidum, Tp)感染引起的梅毒对人体可造成组织损伤和多器官功能障碍，其早期皮损大大增加了人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)的感染和传播，还可以通过母婴传播威胁下一代健康，已成为严重的公共卫生问题。随着DNA技术的发展，高通量、自动化、易于标准的筛查试验大量出现，酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)和化学发光免疫分析(Chemiluminescent immunoassay, CLIA)广泛应用于人群的筛查和疾病诊断，这些试验采用多种重组蛋白组合作为抗原，敏感性可高达100%，但是特异性尚不够理想。
近年来，国内外较多实验室采用反向筛查方法，即先采用ELISA/CLIA筛查，阳性血清再进行甲苯胺红不加热血清试验(Tolulized red unheated serum test， TRUST)/快速血浆反应素试验(Rapid plasma reagin,RPR)。反向筛查中发现，在梅毒低流行人群中，ELISA/CLIA结果出现了较高的假反应性，不仅给检验工作带来了错误的结果，影响临床诊断，而且会增加患者的心理负担和就医支出，甚至引起医疗纠纷，必须重视。Tp47蛋白作为检测梅毒特异性抗体的主要抗原之一，但有研究报道，Tp47中有一段氨基酸序列与人纤维连接蛋白序列有较高的同源性，这可能是梅毒筛查结果中出现假反应性的原因之一。因此，对目前的诊断用抗原进行优化，去除特异性差的片段，提高检测试剂特异性，将可能成为解决现存在的假反应性问题的重要方案。
目的：
1)通过生物信息学预测梅毒螺旋体B细胞抗原表位，表达优势表位融合片段。为评估优势表位融合蛋白在梅毒血清学诊断中的应用提供物质基础，也为未来获得各类新的优势表位融合蛋白奠定基础。
2)对表位融合片段进行HRP标记并建立双抗原夹心ELISA检测方法，进一步探讨表位融合片段作为抗原在梅毒血清学诊断中解决假反应性问题的可行性，为建立新一代梅毒血清学诊断方法提供依据。
方法：
1)根据梅毒螺旋体Nichols株Tp47蛋白的氨基酸序列，通过生物信息学技术预测其B细胞表位，选取得分数较高的多个片段，利用重叠PCR技术连接优势表位片段获得表位融合片段，构建pET-28b-表位融合片段的表达载体并转化入BL21(DE3)感受态细胞中，IPTG诱导表达后使用亲和层析法纯化，对表达的优势表位融合片段进行质谱分析和免疫印迹鉴定。
2)用过碘酸钠法在低温避光条件下对表位融合片段进行HRP标记，建立双抗原夹心ELISA方法。检测96例Architecti2000梅毒阳性血清标本(1＜S/CO＜10)，以TPPA检测结果为标准，比较优势表位融合片段与Tp47蛋白在梅毒特异性抗体检测中的敏感性和特异性，评估优势表位融合片段的诊断性能。
结果：
1)选择的Tp47蛋白B细胞抗原决定簇的区域分别是81-120aa，160-260aa，300-390aa三个片段。通过重叠PCR扩增成功获得表位融合片段基因，成功构建表达载体pET-28b-表位融合片段，测序结果与GenBank数据库中的序列完全一致，质谱鉴定结果和免疫印迹结果表明成功获得表位融合片段。
2)成功获得HRP标记的表位融合片段。以TPPA结果作为标准，表位融合片段双抗原夹心ELISA的敏感性和特异性为90.32%(56/62)和94.12%(32/34),与TPPA结果的检测符合率为91.67%，检测结果的差异无统计学意义(P＞0.05)。Tp47的双抗原ELISA法检测敏感性和特异性分别为93.55%(58/62)和79.41%(27/34)，与TPPA结果的检测符合率为88.54%，检测结果的差异无统计学意义(P＞0.05)。
结论：
与Tp47蛋白相比，表位融合片段作为抗原的ELISA方法的总符合率增高，特异性明显提高，但敏感性稍显不足。提示通过优化抗原能够提高检测的特异性，可以降低梅毒检测的假反应性，为发展新一代梅毒血清学诊断抗原提供方法。