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第一部分 Caspase-3在异氟烷致海马神经干细胞增殖能力减弱中的非凋亡作用 目的：研究Caspase-3在异氟烷致海马神经干细胞增殖能力减弱中的非凋亡作用。 方法：从出生一天的大鼠海马获取神经干细胞进行体外培养。神经干细胞培养3 d，免疫荧光法检测Nestin阳性细胞比例鉴定神经干细胞纯度。异氟烷处理后1、3、5 h，免疫荧光方法检测BrdU阳性细胞比例以反映神经干细胞增殖能力。异氟烷处理后72 h，光学显微镜下观察新生的神经干细胞数量。异氟烷处理后1、3、5 h，TUNEL和LDH实验检测神经干细胞凋亡水平。Western blot法检测神经干细胞中活化Caspase-3蛋白表达水平。免疫荧光双标 TUNEL和Caspase-3，分析异氟烷作用后神经干细胞Caspase-3表达与细胞凋亡之间的关系。 结果：神经干细胞体外培养3 d，Nestin阳性细胞比例大于92％。2.4%和3.6%异氟烷处理6 h后，神经干细胞活化Caspase-3蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）。2.4%异氟烷处理6 h后，神经干细胞活化Caspase-3蛋白表达水平在第1 h达到峰值，之后活化Caspase-3的蛋白表达水平逐渐降低（P<0.05）。而异氟烷导致神经干细胞BrdU阳性细胞比例显著减少（P<0.05）。Caspase-3和TUNEL免疫荧光双标结果显示TUNEL+caspase-3+细胞活化caspase-3主要表达细胞核中；而TUNEL-caspase-3+细胞活化caspase-3主要表达细胞胞浆中。定量分析结果表明，异氟烷（2.4%，6 h）处理后，caspase-3+阳性细胞中 TUNEL-细胞比例增加（P<0.05）。但同样的异氟烷处理对神经干细胞 TUNEL阳性细胞比例、细胞色素 c蛋白表达水平及 LDH释放无显著影响（P?0.05）。2μM的Caspase-3抑制剂Z-DEVD-fmk及泛Caspase抑制剂10μM的Z-VAD-fmk均能有效缓解异氟烷诱发的神经干细胞增殖能力下降（P<0.05），而2μM的Caspase-8抑制剂Z-IETD-fmk则无此效果（P?0.05）。光镜下对异氟烷处理后72 h神经球形成数量计数，结果表明，2μM的Z-DEVD-fmk能有效缓解异氟烷所致异氟烷所致神经球形成减少（P<0.05），而2μM的Caspase-8抑制剂Z-IETD-fmk及10μM的Z-VAD-fmk均无此效果（P?0.05）。 结论：Caspase-3通过其非凋亡作用在异氟烷所致海马神经干细胞增殖能力减退中发挥重要作用。 第二部分 Caspase-3在异氟烷所致海马神经干细胞分化功能异常中的作用 目的：研究Caspase-3在异氟烷所致海马神经干细胞分化功能异常中的作用。 方法：从出生一天的大鼠海马获取神经干细胞进行体外培养。神经干细胞在增殖培养基培养3 d，之后使用1%FBS诱发分化并同时接受2.4%异氟烷处理6 h。Western blot法检测分化过程中神经干细胞活化 Caspase-3、神经元标记物 Tuj-1、GFAP及 Nestin蛋白表达水平。免疫荧光方法检测异氟烷处理后72 h，分化产生的Tuj-1和GFAP阳性细胞比例。LDH法检测分化神经干细胞损伤或死亡程度。 结果：异氟烷（2.4%，6 h）处理后12和24 h，分化神经干细胞中活化caspase-3蛋白表达水平较对照组显著升高（P<0.05）。而异氟烷（2.4%，6 h）处理后，分化神经干细胞LDH释放水平无显著变化（P?0.05）。同时，异氟烷（2.4%，6 h）可诱发分化开始后24 h细胞Tuj-1和GFAP蛋白表达增加（P<0.05），而抑制分化神经干细胞caspase-3活性可逆转异氟烷诱发的Tuj-1和GFAP蛋白表达上调（P<0.05）。另外，异氟烷（2.4%，6 h）处理亦可诱发分化开始后24 h细胞Nestin蛋白表达减少（P<0.05），而抑制分化神经干细胞caspase-3活性同样可逆转异氟烷诱发的Nestin蛋白表达下调（P<0.05）。类似的，免疫荧光分析结果表明，异氟烷（2.4%，6 h）处理可诱发分化开始后72 h产生的Tuj-1阳性细胞比例增加（P<0.05），而不影响GFAP阳性细胞比例（P?0.05），而抑制分化神经干细胞caspase-3活性可以缓解异氟烷诱发Tuj-1阳性细胞比例增加（P<0.05）。 结论：异氟烷通过激活caspase-3促使分化状态神经干细胞向神经元分化。 目的：研究异氟烷是否通过caspase-3/PTEN信号通路导致海马神经干细胞增殖和分化异常。 方法：从出生一天的大鼠海马获取神经干细胞进行体外培养。神经干细胞在增殖培养基培养3 d。一部分细胞在增殖培养基中继续培养并接受异氟烷处理用于细胞增殖实验；另一部分使用1%FBS诱发神经干细胞分化并接受异氟烷处理。细胞增殖实验中，免疫荧光方法检测BrdU阳性细胞比例，光学显微镜下观察新生神经球数量。细胞分化实验中，免疫荧光方法检测异氟烷处理72 h神经干细胞分化产生Tuj-1和GFAP阳性细胞比例。Western blot法检测分化过程中神经干细胞活化Caspase-3、磷酸化PTEN、Tuj-1、GFAP及Nestin的蛋白表达水平。 结果：异氟烷处理（2.4%，6 h）后1h，增殖状态海马神经干细胞PTEN磷酸化水平下降（P<0.05）。使用Caspase-3抑制剂Z-DEVD-fmk（2μM）可缓解异氟烷导致的PTEN磷酸化水平下调（P<0.05）。异氟烷（2.4%，6 h）或Caspase-3抑制剂Z-DEVD-fmk（2μM）处理并不影响增殖状态海马神经干细胞ERK1/2及p38MAPK信号通路（P?0.05）。抑制PTEN信号通路活性可以缓解异氟烷诱发的神经干细胞BrdU阳性细胞数及新生神经球数量下降下降（P<0.05）。而分化状态海马神经干细胞在异氟烷处理（2.4%，6 h）后1h，PTEN磷酸化水平下降（P<0.05）。使用Caspase-3抑制剂 Z-DEVD-fmk（2μM）可缓解异氟烷造成的分化状态海马神经干细胞PTEN磷酸化水平下调（P<0.05）。抑制PTEN信号通路活性可缓解异氟烷造成海马神经干细胞Nestin、Tuj-1及GFAP表达异常（P<0.05）。同样，免疫荧光定量分析结果显示抑制PTEN信号通路活性可缓解异氟烷造成海马神经干细胞神经元分化倾向（P<0.05）。 结论：异氟烷可通过caspase-3/PTEN信号通路导致海马神经干细胞增殖和分化异常。 第四部分美金刚缓解异氟烷致神经干细胞增殖能力减退 目的：通过体外实验探讨美金刚缓解异氟烷致神经干细胞增殖能力减退及其可能机制。 方法：从出生一天的大鼠海马获取神经干细胞进行体外培养。这些神经干细胞被随机分入5组，包括对照组（control组）、溶剂对照组（Vehicle组）、异氟烷组（ISO组）、异氟烷+美金刚组（ISO+ Mem组）和异氟烷+美金刚+ LY294002组（ISO+ Mem+ LY组）。通过检测BrdU在增殖神经干细胞中的表达反映神经干细胞增殖水平。Western blot法检测神经元中磷酸化Akt的蛋白表达水平。 结果：2.4%异氟烷暴露6 h后神经干细胞的增殖能力和磷酸化Akt的蛋白表达水平都显著下降（P<0.01）。而美金刚可同时缓解异氟烷所致神经干细胞增殖能力减退和磷酸化Akt的蛋白表达水平下降（P<0.01）。使用Akt通路特异性抑制剂LY294002可逆转美金刚对神经干细胞增殖的保护作用（P<0.01）。 结论：美金刚可通过激活Akt信号转导通路缓解异氟烷所致神经干细胞增殖能力减退。