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第一部分：大鼠心肌缺血再灌注期间乳酸穿梭系统相关蛋白表达变化 【目的】研究大鼠心肌缺血再灌注过程中乳酸穿梭系统相关蛋白以及乳酸浓度的变化,并观察心肌缺血再灌注损伤时是否存在乳酸穿梭现象。 【方法】雄性SPF级大鼠72只,分别采用Langendorff法和左冠状动脉结扎法建立大鼠心肌缺血再灌注模型。根据缺血再灌注时间的不同随机分为平衡灌注20min组,缺血30min组,复灌15min组和复灌60min组,留取各组心肌组织,收集各组终末时间点的冠脉流出液或血液。RT-PCR法检测各组心肌细胞MCT1,MCT4mRNA含量;Westernblot检测MCT1,MCT4,CD147,AMPK,P-AMPK蛋白含量;Elisa法检测心肌组织LDH含量并测定其活性;测定冠脉流出液或血清乳酸浓度。 【结果】两种模型均显示正常情况下心脏MCT1,MCT4均有表达,MCT4表达较少;缺血30min后,MCT4表达明显增加,而MCT1表达基本无变化;再灌注15分钟后,MCT1表达明显增加,MCT4表达明显下降;再灌注60min后MCT1,MCT4表达回归缺血前水平。CD147及LDH在缺血30min和再灌注15min表达活跃。而AMPK在缺血30min和再灌注15min活化程度明显增加。乳酸浓度在缺血30min后明显增高,再灌注15min后浓度明显下降至正常水平至60min结束。 【结论】心肌缺血时MCT4增多,乳酸浓度增高,再灌注时MCT1增多,乳酸浓度下降,缺血再灌注过程中乳酸穿梭相关蛋白表达均活跃,MCT的表达增多伴随着AMPK活化程度增加。心肌缺血再灌注期间存在乳酸穿梭。 第二部分：MCT介导的乳酸穿梭在大鼠心肌缺血再灌注期间的作用研究 【目的】通过右旋乳酸竞争性抑制心肌缺血再灌注过程中的乳酸穿梭,判断乳酸穿梭在心肌缺血再灌注中的作用。 【方法】36只雄性SPF级大鼠,随机分为正常缺血再灌注组(I/R组),左旋乳酸灌注组(L-LAC),右旋乳酸灌注组(D-LAC),采用Langendorff法建立心肌缺血再灌注模型,其中稳定20min,停灌30min,复灌60min。L-LAC组和D-LAC组在缺血前5min各灌入100mML型或D型乳酸。观察各组再灌注过程中血流动力学指标评估心肌机械功能恢复情况,灌注完毕后收集冠脉流出液,留取心肌组织,Elisa法检测灌流液cTnI含量评价心肌损伤程度,TUNEL法检测心肌细胞凋亡情况,TTC法检测心肌梗死范围,心肌HE染色观察心肌病理变化。 【结果】D-LAC组再灌注过程中血流动力学指标的恢复情况明显差于L-LAC和I/R组,而后两组无明显差异;D-LAC组灌流液中cTnI浓度明显高于其他两组;TUNEL测定结果显示灌注结束后D-LAC组心肌组织阳性细胞数显著增加,而后两组无明显差异,D-LAC组心肌凋亡增加;TTC结果显示D-LAC组心肌梗死面积扩大,其他两组无明显差异。HE染色示D-LAC组心肌细胞水肿严重,心肌纤维断裂,其他两组心肌细胞排列大致紧密。 【结论】右旋乳酸阻断心肌缺血再灌注中的正常的乳酸穿梭使心肌功能恶化,心肌梗死面积增加,心肌细胞凋亡数目增多,损伤程度加重。乳酸穿梭对心肌缺血再灌注有保护作用。 第三部分：阿卡地新对大鼠心肌缺血再灌注乳酸穿梭的影响 【目的】观察阿卡地新对心肌缺血再灌注期间MCT蛋白表达水平及心肌损伤的影响。 【方法】雄性SPF级大鼠48只,建立LANGENDORFF模型后,随机分为两组,一组为AICAR组,一组为对照组,AICAR组灌流液含2mmol/L的AICAR,其余成分同对照组。两组离体心脏平衡20min后按缺血再灌注时间点又各分为缺血45min组,缺血45min后再灌注15min组和再灌注60min组三个亚组。留取各组心肌组织RT-PCR法检测MCT1,MCT4mRNA水平,Westernblot检测MCT1,MCT4,AMPK,及p-AMPK蛋白水平,TUNEL法检测心肌细胞凋亡,TTC法检测心肌梗死。测定灌流液中LDH活性评价心肌损伤程度。 【结果】与对照组相比,AICAR组心肌缺血再灌注期间AMPK活化水平明显增高,再灌注初期的MCT1,缺血期的MCT4的mRNA及蛋白水平表达明显增高。AICAR组心肌TUNEL阳性细胞数较少且损伤程度较对照组轻。 【结论】AICAR促进AMPK活化具有明显的乳酸穿梭激动效应,加强了其在缺血再灌注过程中的心肌保护作用,这可能为我们提供了一种缺血再灌注损伤新的治疗策略。