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EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)属γ疱疹病毒亚科,全球成人的感染率高达90%以上,能够在宿主细胞内长期潜伏,与多种人类肿瘤的发生有关,是公认的DNA肿瘤病毒.EBV相关肿瘤中几乎所有的肿瘤细胞均可检测到EBV基因组的存在,EBV在宿主细胞中建立的潜伏感染是其重要的致癌基础,EBV通过其潜伏期基因产物影响受感染细胞的基因表达及生物学行为参与相关肿瘤的发生发展.EBV相关胃癌(EBV-associated gastric carcinoma, EBVaGC)是胃癌的一种独特亚型,是发病人数最高的EBV相关肿瘤,与EBV阴性胃癌(EBV-negative gastric carcinoma, EBVnGC)相比具有独特的临床病理特征,但其发病机制尚未完全明了.EBV编码的潜伏基因产物可参与多种细胞信号通路的传导,如NF-κB、JNK、STAT3和PI3K/AKT等,通过一系列级联反应参与宿主细胞基因和病毒基因的表达调控,诱导细胞转化、促进细胞增殖、抑制细胞的分化和凋亡,从而导致EBV相关肿瘤的发生.转录因子NF-κB是与细胞增殖、免疫反应、炎症反应和肿瘤密切相关的重要的调节因子,持续激活的NF-κB信号通路能够通过上调其下游分子的表达来诱导细胞增殖,抑制肿瘤细胞的凋亡.NF-κB信号通路在肿瘤发生发展中的重要作用在多种EBV相关肿瘤中已被阐述,但其在EBVaGC中的具体作用机制还不明确.
目的:①通过检测胃癌细胞系及胃癌组织中NF-κB经典信号通路相关分子的表达及亚细胞定位,明确EBVaGC和EBVnGC中NF-κB经典信号通路的激活情况.②探讨EBV通过潜伏感染激活NF-κB经典信号通路的具体机制.③检测分析NF-κB信号通路对EBV阳性胃癌细胞增殖和凋亡等细胞生物学行为,以及EBV潜伏膜蛋白LMP1、LMP2A表达的影响.
方法:①提取EBV阴性胃癌细胞系(SGC7901, BGC823, HGC27)、EBV阳性胃癌细胞系(GT38, GT39, SNU719)总RNA和总蛋白,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)对NF-κB信号通路相关分子(NFKBIA、TRAF1/2/3/6)的转录表达进行检测;Westernblot检测并分析其蛋白表达水平;免疫荧光技术检测胃癌细胞系中p65蛋白的亚细胞定位;ELISA技术检测细胞系中NF-κB转录因子与DNA结合能力,综合判断NF-κB信号通路在胃癌细胞系中的激活情况.
②免疫组化技术检测EBVaGC和EBVnGC肿瘤组织中IκBα及p65蛋白表达及亚细胞定位.
③采用不同浓度的NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082作用EBV阳性胃癌细胞系SNU719及EBV阴性胃癌细胞系SGC7901,24h后CCK-8检测细胞存活情况.
④采用流式细胞技术及Annexin-FITC试剂盒分别检测浓度为2.5μM、5μM和10μM的NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082作用12h后对EBV阳性胃癌细胞系GT38凋亡的影响.Westernblot检测BAY11-7082、MG-132不同浓度及不同处理时间IκBα和磷酸化IκBα以及凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3)的表达.
⑤采用2.5μM,5μM,10μM浓度的BAY11-7082作用EBV阳性胃癌细胞系GT38,12h后收集细胞提取总蛋白,Westernblot检测转录因子ZEB1蛋白的表达变化情况.
⑥采用BGS特异性引物对NFKBIA基因启动子区进行扩增,该区域含有83个CpG位点,随机选取扩增条带进行TA克隆,每个样本挑选6个克隆,根据所测6个TA克隆总CpG位点中发生甲基化的比例计算甲基化率.
⑦PCR结合DNA测序技术检测胃癌细胞系IκBα基因突变情况.
⑧miRBase和rna22网站预测EBV编码的miR-BART16含有IκBα3UTR结合位点,将IκBα3UTR靶定序列或其突变序列分别克隆至双荧光素酶报告基因质粒,连同相应的模拟物共转染HEK293T细胞检测其荧光素酶的表达.
⑨构建分别携带EBV潜伏膜蛋白LMP1和LMP2A编码基因的重组表达质粒,分别转染EBV阴性胃癌细胞系SGC7901,同时设置空载对照.收集转染2h、6h、24h、48h、72h的实验组细胞,并提取各组细胞总蛋白,Westernblot检测相关蛋白表达的变化.设计并合成靶向LMP1编码基因的siRNA及对照序列(NC),转染EBV阳性胃癌细胞系GT38,作用48h收集细胞,提取细胞总蛋白和总RNA,Westernblot和qRT-PCR检测IκBα的表达变化.
⑩分别转染LMP1和LMP2A重组质粒至EBV阴性胃癌细胞系SGC7901,同时设置空载对照质粒,G418筛选实验及流式细胞仪分选后建立稳定表达LMP1和LMP2A的SGC7901细胞克隆以及载体对照细胞系,Westernblot检测稳定表达外源性LMP1和LMP2A的细胞克隆NF-κB信号通路相关基因的表达.
(11)设计并合成靶向TRAF1编码基因的siRNA转染EBV阳性胃癌细胞系GT39,检测下调TRAF1表达对NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响.
(12)采用qRT-PCR和免疫组织化学技术检测EBV阳性胃癌细胞系GT38、GT39及EBVaGC组织中miR-BART16与LMP1的相对表达水平.
(13)在GT38和GT39细胞系中分别转染miR-BART16的模拟物、抑制物及对照序列,浓度分别为10nM,30nM和50nM,作用48h收集细胞,提取各组细胞总RNA和总蛋白检测LMP1的表达.选取50nM浓度miR-BART16模拟物、抑制物及对照序列,分别转染GT38和GT39细胞,采用CCK-8检测转染24h,48h,72h的细胞增殖情况.
(14)miR-BART16模拟物与抑制物作用GT38、GT39细胞48h,采用流式细胞技术检测对细胞凋亡的影响,同时采用PI及BrdU染色分析miR-BART16模拟物与抑制物作用后对细胞周期的影响.
结果:①EBV阳性胃癌细胞系NF-κB信号通路抑制因子NFKBIA的转录表达水平明显低于EBV阴性胃癌细胞系(P＜0.005),EBV阳性胃癌细胞系中TRAF1、TRAF3、TRAF6转录水平均高于EBV阴性胃癌细胞系,TRAF2转录水平明显低于阴性胃癌细胞系;EBV阳性胃癌细胞系中IκBα蛋白表达均较EBV阴性胃癌细胞系明显降低;而两种细胞系中磷酸化IκBα蛋白的表达则无明显差异;p65及p-p65蛋白表达亦无明显差异.EBV阳性胃癌细胞系中TRAF1蛋白表达明显高于EBV阴性胃癌细胞,而EBV阳性胃癌细胞系TRAF2、TRAF3和TRAF6蛋白的表达均低于EBV阴性胃癌细胞系.
②EBV阳性胃癌细胞系中p65蛋白的核内转位约占50%,而EBV阴性胃癌细胞系则较少检测到核内转位.EBV阳性胃癌细胞系GT38、GT39和SNU719的p65-DNA结合能力均高于EBV阴性胃癌细胞系.
③EBVaGC组织中IκBαmRNA的转录表达水平明显低于EBVnGC组织及癌旁组织,EBVaGC组织中IκBα蛋白表达较EBVnGC组织弱,而发生p65核转位的肿瘤细胞多于EBVnGC组织.
④EBV阳性胃癌细胞系SNU719对NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082作用的敏感性明显强于EBV阴性胃癌细胞系SGC7901.
⑤与DMSO对照组比较,2.5μMBAY11-7082处理组SNU719细胞凋亡率无明显变化(P>0.5),5μM和10μM处理组的细胞凋亡率明显升高,最高达51.5%,差异有显著性(P<0.001).MG-132及BAY11-7082信号通路抑制剂作用后均能对凋亡相关蛋白的表达产生不同程度的影响.
⑥2.5μM浓度BAY11-7082作用细胞后ZEB1蛋白表达无明显变化(P>0.5),5μM和10μM浓度作用后,ZEB1蛋白表达明显下调(P<0.01).
⑦EBV阳性胃癌细胞系中NFKBIA基因启动子区甲基化率:GT38为0.80%,GT39为0.80%,SNU719为0.4%,均呈低甲基化状态.
⑧EBV阳性胃癌细胞系GT38、GT39和SNU719NFKBIA基因第一外显子区均存在12bp的片段缺失(+615~+626delCGCCCCCAGGAG),造成4个氨基酸的丢失,而在EBV阴性胃癌细胞系未检测到该片段的缺失.
⑨EBV-miR-BART16不能直接影响带有h-NFKBIA-3UTR的荧光素酶的表达,IκBα的表达不受miR-BART16的直接调控.
⑩与载体对照组比较,转染LMP1重组表达质粒的SGC7901细胞IκBα各时间段均表达下调,72h表达量是对照组的40%,磷酸化p-IκBα表达上调,在7h表达水平最高(2.15倍);p65总蛋白的表达较对照组降低,而磷酸化p-p65表达随作用时间上调.TRAF1表达上调,72h可达2.01倍,而TRAF2/3/6表达下调.干扰LMP1,其mRNA表达是对照组的26%,而IκBα的mRNA转录表达未见明显改变(P>0.05),LMP1蛋白水平表达下调,IκBα蛋白表达水平则出现上调现象.
(11)与空白对照比较,转染LMP2A重组表达质粒的SGC7901细胞IκBα各时间段均表达下调,48h下调最明显,表达量仅是对照组的29%,p-IκBα的表达上调,在72h达到最高(3.32倍);p65总蛋白的表达较对照组降低,而p-p65表达随作用时间而上调.TRAF1表达上调,72h可达2.51倍,而TRAF2/3表达下调,TRAF6略有下调.
(12)与空白对照比较,稳定转染LMP1/2A均能下调IκBα表达,表达量仅是对照组的67%和61%,p-IκBα的表达上调,为对照组的1.35倍和1.47倍,p65总蛋白和磷酸化蛋白的表达无明显差异,TRAF1分别上调2.15倍和1.46倍,而TRAF2/6表达下调,TRAF3表达无明显变化.
(13)靶向TRAF1的siRNA作用EBV阳性胃癌细胞系GT3948h和72h后,p65和IκBα总蛋白及磷酸化蛋白表达均未发生明显变化.
(14)与GT38和GT39细胞系比较,EBVaGC组织中miRNA-BART16表达量明显高于2种EBV阳性胃癌细胞系,约为14-165倍.qRT-PCR及免疫组化技术在10例EBVaGC组织中均未检测到LMP1的表达.
(15)与阴性对照组比较,GT38和GT39细胞系转染miR-BART16模拟物后,LMP1mRNA与蛋白表达水平均随转染浓度的增加而降低;而转染miRNA-BART16抑制物以后,LMP1mRNA与蛋白表达水平均随转染浓度的增加而增加,呈明显的量效关系.
(16)miR-BART16转染GT38和GT39细胞48h和72h后,CCK-8检测显示其模拟物能够明显抑制细胞增殖(P<0.05),而转染miR-BART16抑制物后,细胞增殖明显增强(P<0.05).
(17)在GT38和GT39细胞中转染miR-BART16模拟物及抑制物,细胞凋亡没有发生明显变化(P>0.05);转染miR-BART16抑制物48h后,细胞周期阻滞在G2/M期,而转染模拟物后没有明显的变化.
结论:①EBV阳性胃癌的细胞系和EBVaGC组织均存在NF-κB经典信号通路的持续激活,LMP1和LMP2A的表达是该信号通路激活的重要原因.
②NF-κB信号通路的激活可促进上皮细胞间质转化相关分子及潜伏膜蛋白的表达,从而导致EBV阳性肿瘤细胞增殖,抑制其凋亡.
③κBα基因第一外显子在EBV阳性胃癌细胞系存在一段12bp的缺失,造成4个氨基酸的丢失.
④EBVaGC中IκBα基因的低表达不受启动子区甲基化和miR-BART16的调控.
⑤miR-BART16能够在mRNA及蛋白水平下调LMP1的表达,抑制miR-BART16表达能够促进细胞增殖,诱导细胞G2/M期阻滞.
目的:①通过检测胃癌细胞系及胃癌组织中NF-κB经典信号通路相关分子的表达及亚细胞定位,明确EBVaGC和EBVnGC中NF-κB经典信号通路的激活情况.②探讨EBV通过潜伏感染激活NF-κB经典信号通路的具体机制.③检测分析NF-κB信号通路对EBV阳性胃癌细胞增殖和凋亡等细胞生物学行为,以及EBV潜伏膜蛋白LMP1、LMP2A表达的影响.
方法:①提取EBV阴性胃癌细胞系(SGC7901, BGC823, HGC27)、EBV阳性胃癌细胞系(GT38, GT39, SNU719)总RNA和总蛋白,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)对NF-κB信号通路相关分子(NFKBIA、TRAF1/2/3/6)的转录表达进行检测;Westernblot检测并分析其蛋白表达水平;免疫荧光技术检测胃癌细胞系中p65蛋白的亚细胞定位;ELISA技术检测细胞系中NF-κB转录因子与DNA结合能力,综合判断NF-κB信号通路在胃癌细胞系中的激活情况.
②免疫组化技术检测EBVaGC和EBVnGC肿瘤组织中IκBα及p65蛋白表达及亚细胞定位.
③采用不同浓度的NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082作用EBV阳性胃癌细胞系SNU719及EBV阴性胃癌细胞系SGC7901,24h后CCK-8检测细胞存活情况.
④采用流式细胞技术及Annexin-FITC试剂盒分别检测浓度为2.5μM、5μM和10μM的NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082作用12h后对EBV阳性胃癌细胞系GT38凋亡的影响.Westernblot检测BAY11-7082、MG-132不同浓度及不同处理时间IκBα和磷酸化IκBα以及凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3)的表达.
⑤采用2.5μM,5μM,10μM浓度的BAY11-7082作用EBV阳性胃癌细胞系GT38,12h后收集细胞提取总蛋白,Westernblot检测转录因子ZEB1蛋白的表达变化情况.
⑥采用BGS特异性引物对NFKBIA基因启动子区进行扩增,该区域含有83个CpG位点,随机选取扩增条带进行TA克隆,每个样本挑选6个克隆,根据所测6个TA克隆总CpG位点中发生甲基化的比例计算甲基化率.
⑦PCR结合DNA测序技术检测胃癌细胞系IκBα基因突变情况.
⑧miRBase和rna22网站预测EBV编码的miR-BART16含有IκBα3UTR结合位点,将IκBα3UTR靶定序列或其突变序列分别克隆至双荧光素酶报告基因质粒,连同相应的模拟物共转染HEK293T细胞检测其荧光素酶的表达.
⑨构建分别携带EBV潜伏膜蛋白LMP1和LMP2A编码基因的重组表达质粒,分别转染EBV阴性胃癌细胞系SGC7901,同时设置空载对照.收集转染2h、6h、24h、48h、72h的实验组细胞,并提取各组细胞总蛋白,Westernblot检测相关蛋白表达的变化.设计并合成靶向LMP1编码基因的siRNA及对照序列(NC),转染EBV阳性胃癌细胞系GT38,作用48h收集细胞,提取细胞总蛋白和总RNA,Westernblot和qRT-PCR检测IκBα的表达变化.
⑩分别转染LMP1和LMP2A重组质粒至EBV阴性胃癌细胞系SGC7901,同时设置空载对照质粒,G418筛选实验及流式细胞仪分选后建立稳定表达LMP1和LMP2A的SGC7901细胞克隆以及载体对照细胞系,Westernblot检测稳定表达外源性LMP1和LMP2A的细胞克隆NF-κB信号通路相关基因的表达.
(11)设计并合成靶向TRAF1编码基因的siRNA转染EBV阳性胃癌细胞系GT39,检测下调TRAF1表达对NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响.
(12)采用qRT-PCR和免疫组织化学技术检测EBV阳性胃癌细胞系GT38、GT39及EBVaGC组织中miR-BART16与LMP1的相对表达水平.
(13)在GT38和GT39细胞系中分别转染miR-BART16的模拟物、抑制物及对照序列,浓度分别为10nM,30nM和50nM,作用48h收集细胞,提取各组细胞总RNA和总蛋白检测LMP1的表达.选取50nM浓度miR-BART16模拟物、抑制物及对照序列,分别转染GT38和GT39细胞,采用CCK-8检测转染24h,48h,72h的细胞增殖情况.
(14)miR-BART16模拟物与抑制物作用GT38、GT39细胞48h,采用流式细胞技术检测对细胞凋亡的影响,同时采用PI及BrdU染色分析miR-BART16模拟物与抑制物作用后对细胞周期的影响.
结果:①EBV阳性胃癌细胞系NF-κB信号通路抑制因子NFKBIA的转录表达水平明显低于EBV阴性胃癌细胞系(P＜0.005),EBV阳性胃癌细胞系中TRAF1、TRAF3、TRAF6转录水平均高于EBV阴性胃癌细胞系,TRAF2转录水平明显低于阴性胃癌细胞系;EBV阳性胃癌细胞系中IκBα蛋白表达均较EBV阴性胃癌细胞系明显降低;而两种细胞系中磷酸化IκBα蛋白的表达则无明显差异;p65及p-p65蛋白表达亦无明显差异.EBV阳性胃癌细胞系中TRAF1蛋白表达明显高于EBV阴性胃癌细胞,而EBV阳性胃癌细胞系TRAF2、TRAF3和TRAF6蛋白的表达均低于EBV阴性胃癌细胞系.
②EBV阳性胃癌细胞系中p65蛋白的核内转位约占50%,而EBV阴性胃癌细胞系则较少检测到核内转位.EBV阳性胃癌细胞系GT38、GT39和SNU719的p65-DNA结合能力均高于EBV阴性胃癌细胞系.
③EBVaGC组织中IκBαmRNA的转录表达水平明显低于EBVnGC组织及癌旁组织,EBVaGC组织中IκBα蛋白表达较EBVnGC组织弱,而发生p65核转位的肿瘤细胞多于EBVnGC组织.
④EBV阳性胃癌细胞系SNU719对NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082作用的敏感性明显强于EBV阴性胃癌细胞系SGC7901.
⑤与DMSO对照组比较,2.5μMBAY11-7082处理组SNU719细胞凋亡率无明显变化(P>0.5),5μM和10μM处理组的细胞凋亡率明显升高,最高达51.5%,差异有显著性(P<0.001).MG-132及BAY11-7082信号通路抑制剂作用后均能对凋亡相关蛋白的表达产生不同程度的影响.
⑥2.5μM浓度BAY11-7082作用细胞后ZEB1蛋白表达无明显变化(P>0.5),5μM和10μM浓度作用后,ZEB1蛋白表达明显下调(P<0.01).
⑦EBV阳性胃癌细胞系中NFKBIA基因启动子区甲基化率:GT38为0.80%,GT39为0.80%,SNU719为0.4%,均呈低甲基化状态.
⑧EBV阳性胃癌细胞系GT38、GT39和SNU719NFKBIA基因第一外显子区均存在12bp的片段缺失(+615~+626delCGCCCCCAGGAG),造成4个氨基酸的丢失,而在EBV阴性胃癌细胞系未检测到该片段的缺失.
⑨EBV-miR-BART16不能直接影响带有h-NFKBIA-3UTR的荧光素酶的表达,IκBα的表达不受miR-BART16的直接调控.
⑩与载体对照组比较,转染LMP1重组表达质粒的SGC7901细胞IκBα各时间段均表达下调,72h表达量是对照组的40%,磷酸化p-IκBα表达上调,在7h表达水平最高(2.15倍);p65总蛋白的表达较对照组降低,而磷酸化p-p65表达随作用时间上调.TRAF1表达上调,72h可达2.01倍,而TRAF2/3/6表达下调.干扰LMP1,其mRNA表达是对照组的26%,而IκBα的mRNA转录表达未见明显改变(P>0.05),LMP1蛋白水平表达下调,IκBα蛋白表达水平则出现上调现象.
(11)与空白对照比较,转染LMP2A重组表达质粒的SGC7901细胞IκBα各时间段均表达下调,48h下调最明显,表达量仅是对照组的29%,p-IκBα的表达上调,在72h达到最高(3.32倍);p65总蛋白的表达较对照组降低,而p-p65表达随作用时间而上调.TRAF1表达上调,72h可达2.51倍,而TRAF2/3表达下调,TRAF6略有下调.
(12)与空白对照比较,稳定转染LMP1/2A均能下调IκBα表达,表达量仅是对照组的67%和61%,p-IκBα的表达上调,为对照组的1.35倍和1.47倍,p65总蛋白和磷酸化蛋白的表达无明显差异,TRAF1分别上调2.15倍和1.46倍,而TRAF2/6表达下调,TRAF3表达无明显变化.
(13)靶向TRAF1的siRNA作用EBV阳性胃癌细胞系GT3948h和72h后,p65和IκBα总蛋白及磷酸化蛋白表达均未发生明显变化.
(14)与GT38和GT39细胞系比较,EBVaGC组织中miRNA-BART16表达量明显高于2种EBV阳性胃癌细胞系,约为14-165倍.qRT-PCR及免疫组化技术在10例EBVaGC组织中均未检测到LMP1的表达.
(15)与阴性对照组比较,GT38和GT39细胞系转染miR-BART16模拟物后,LMP1mRNA与蛋白表达水平均随转染浓度的增加而降低;而转染miRNA-BART16抑制物以后,LMP1mRNA与蛋白表达水平均随转染浓度的增加而增加,呈明显的量效关系.
(16)miR-BART16转染GT38和GT39细胞48h和72h后,CCK-8检测显示其模拟物能够明显抑制细胞增殖(P<0.05),而转染miR-BART16抑制物后,细胞增殖明显增强(P<0.05).
(17)在GT38和GT39细胞中转染miR-BART16模拟物及抑制物,细胞凋亡没有发生明显变化(P>0.05);转染miR-BART16抑制物48h后,细胞周期阻滞在G2/M期,而转染模拟物后没有明显的变化.
结论:①EBV阳性胃癌的细胞系和EBVaGC组织均存在NF-κB经典信号通路的持续激活,LMP1和LMP2A的表达是该信号通路激活的重要原因.
②NF-κB信号通路的激活可促进上皮细胞间质转化相关分子及潜伏膜蛋白的表达,从而导致EBV阳性肿瘤细胞增殖,抑制其凋亡.
③κBα基因第一外显子在EBV阳性胃癌细胞系存在一段12bp的缺失,造成4个氨基酸的丢失.
④EBVaGC中IκBα基因的低表达不受启动子区甲基化和miR-BART16的调控.
⑤miR-BART16能够在mRNA及蛋白水平下调LMP1的表达,抑制miR-BART16表达能够促进细胞增殖,诱导细胞G2/M期阻滞.