【摘 要】
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越来越多的证据表明骨肉瘤的发生和多基因的联合改变有关，是否最终发生骨肉瘤则取决于多基因的协同作用，而传统中药方剂以其独特的复合成分，在抗肿瘤的多靶点效应上具有越来越明
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越来越多的证据表明骨肉瘤的发生和多基因的联合改变有关，是否最终发生骨肉瘤则取决于多基因的协同作用，而传统中药方剂以其独特的复合成分，在抗肿瘤的多靶点效应上具有越来越明显的优势，是目前研究抗肿瘤治疗的一个热点。本研究的目的旨在:观察传统中药方剂八宝丹对U-2OS骨肉瘤细胞生长的抑制作用，并从分子生物学角度研究八宝丹U-2OS骨肉瘤细胞存在诱导凋亡的作用和其诱导凋亡的作用机制。为达到预期的研究目的本题分成以下三部分: (1)八宝丹对U-2OS细胞体外增殖的影响:以U-2OS人骨肉瘤细胞株为实验对象，八宝丹以不同浓度或不同的作用时间进行干预。通过倒置相差显微镜观察和Weight-giemsa染色观察U-2OS形态变化;四甲基偶氮唑盐(MTT)比色分析检测U-2OS细胞体外增殖活力;免疫组化法检测干预后的U-2OS细胞核内Ki-67表达的改变。结果发现，细胞经八宝丹干预后，细胞增殖明显受到抑制，Weight-giemsa染色出现核染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状，胞质空泡化等变化，Ki-67染色显示实验组核染色深度和比率都明显减低，MTT实验结果来看，八宝丹对于U-2OS细胞的增殖具有抑制作用，并有相关药物浓度依赖关系和作用时间依赖关系。结果提示八宝丹对体外培养的U-2OS细胞的增殖具有抑制作用，且存在一定浓度和时间的依赖性。 (2)八宝丹对U-2OS增殖与其诱导凋亡的关系:凋亡是不同于坏死的程序性细胞死亡，诱导肿瘤细胞凋亡是目前治疗肿瘤的热点。以不同浓度或不同的作用时间进行干预传代培养的U-2OS细胞;应用原位末端标记检测U-2OS的凋亡;以流式细胞仪和细胞基因组DNA电泳方法观察细胞凋亡的发生率，电镜观察U-2OS的结构损伤。结果发现对照组中无TUNEL阳性染色，实验组中有明显阳性染色，并随着八宝丹的作用时间的延长而明显增加;流式细胞仪显示八宝丹诱导U-2OS的凋亡呈浓度和时间依赖性，5mg/ml BBD作用于细胞24小时，其调亡细胞的百分比达到39.9％。电镜观察细胞超微结构显示细胞器肿胀，核染色质浓缩、边积等凋亡现象;凋亡细胞的基因组DNA电泳呈梯状带。结果提示八宝丹能诱导U-2OS细胞凋亡，且存在浓度和时间的依赖性。 (3)八宝丹诱导U-2OS细胞凋亡的机制探讨:Survivin、bcl-2、bax是近年来受到国内外高度重视的有关细胞凋亡的因子。通过RT-PCR和Western-Blot方法从mRNA水平和蛋白水平研究八宝丹对U-2OS细胞的影响。结果表明八宝丹在基因和蛋白质水平均有促进U-2OS细胞凋亡的影响。随着八宝丹浓度的升高或作用时间的延长，U-2OS表达Survivin、bcl-2mRNA的量逐渐降低，而bax mRNA的量逐渐增加。表明八宝丹对U-2OS的诱导凋亡是通过调节其凋亡基因而起作用的。进一步在蛋白组学中也显示随着八宝丹浓度的升高或作用时间的延长，细胞内Survivin蛋白表达逐渐降低。 本实验探讨传统中药八宝丹对U-2OS细胞具有增殖抑制的作用，其机制可能是通过调节多个凋亡相关基因来诱导U-2OS细胞凋亡。以上这些对揭示八宝丹抗肿瘤机理有重要意义。
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