论文部分内容阅读
目的：建立幼年型复发性喉乳头状瘤细胞的原代培养模型，观察细胞生长情况，不同生长因子对原代细胞培养的影响及培养过程中细胞生物学特性的变化，构建HPV11 E6的小干扰RNA，观察RNA干扰效率，为进一步研究复发性呼吸道乳头状瘤的治疗提供方法学基础。
方法：对32例幼年型复发性喉乳头状瘤组织分别采用组织块法和酶消化法进行原代培养，观察不同培养方法对原代培养细胞生长状况的影响；培养前以PCR行HPV分型，四唑盐比色实验观察氢化可的松、胰岛素、碱性成纤维细胞生长因子和β-巯基乙醇四种生长因子对乳头状瘤细胞生长的影响，并用荧光半定量PCR法分析培养后不同时期细胞内病毒含量的变化；设计合成4对针对HPV11E6的siRNA，在293细胞上筛选高干扰效率的siRNA，通过检测不同载体对原代喉乳头状瘤的转染效率，分析RNAi对呼吸道复发性乳头状瘤的治疗前景。
结果：喉乳头状瘤原代细胞培养中组织块法与酶消化法的结果有显著性差异，组织块法优于酶消化法，乳头状瘤细胞体外生长缓慢且存活不超过2周；幼年型喉乳头状瘤的HPV感染率为100％，以11型和6型双重感染为主(81.25％)；氢化可的松、胰岛素和β-巯基乙醇有促乳头状瘤细胞贴壁生长的作用，随着细胞培养时间的延长，细胞内病毒含量增高；在293细胞上的筛选实验中得到3对HPV11 E6的siRNA在eGFP融合蛋白水平有非常明显的基因干扰作用；脂质体对原代喉乳头状瘤细胞亲嗜性差，转染效率低，慢病毒对原代喉乳头状瘤细胞亲嗜性较脂质体好，转染率可达20％～30％左右。
结论：幼年型复发性喉乳头状瘤细胞原代培养适合采用组织块法，该法步骤简单，培养细胞成活率高；喉乳头状瘤原代细胞生长缓慢，适合作为HPV(+)细胞的实验对象；不同的生长因子对喉乳头状瘤细胞生长的影响不同，幼年型复发性喉乳头状瘤的发生发展与HPV的感染密切相关，尤其是HPV6/11型；获得了3对可高效沉默靶基因HPV11 E6的siRNA，且慢病毒可作为转染复发性呼吸道乳头状瘤原代细胞的载体，为下一步体外细胞水平RNAi实验奠定了基础。