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由于血眼屏障的存在,临床应用的中药是否能进入眼内、剂量及作用机制如何一直是无人问津的领域。本研究采用临床常用药物知母,通过对用药后的动物眼内菝葜皂苷元、芒果甙等药物主要有效成分含量的检测,对知母的血眼屏障通透性及治疗药物浓度进行检测;并在此基础上,从酶学、离子监测、蛋白质和基因表达等方面研究知母对眼内代表性的上皮细胞--晶状体上皮细胞、色素上皮细胞等的保护机理。本研究共分为两部分,第一部分是中药知母通过血眼屏障能力的分析。接着对知母的功效进行了研究。通过研究发现,中药知母的有效成分可以通过血眼屏障,并在眼组织内发挥抗氧化的作用。
知母通过血眼屏障能力的检测,因为中药的主要成分的含量与中药的产地、采摘时间、加工炮制等都有关系,为了保证试验的精确性,本研究首先进行药物的提取并定量。经醇提和大孔树脂精制后,经高效液相色谱仪检测,500g知母提取精制的产物为10.5g得率为2.1%。皂甙元SAR在产物中的含量10.5%。提取的皂苷符合规格。用高效液相色谱仪联合蒸发光检测器进行检测,采用的是绝对标准曲线法进行分析。空白溶液对样品的测定无干扰。精密度实验RSD=9.29%:稳定性试验RSD=9.69%:重现性实RSD=0.17%,回收率98.77%,RSD 2.38%。n=5.说明方法可靠。在随后应用的薄层检测中,也证实了此方法的可靠性。高效液相色谱得到的标准回归方程为:药品:lgA=0.61551gM-3.3385,r=0.9990,表明菝葜皂苷元在12.5~50.8μg/ml范围内呈线性关系。眼组织的标准回归方程:lgA=0.843gM-1.476,r=0.9992,表明菝葜皂苷元在2.8~20.8μg/ml范围内呈线性关系。Wister大鼠进行灌胃实验,给药后30分钟,血中菝葜皂苷元的浓度开始升高,150分钟后达到最高值3.90ug/ml,然后逐渐下降。眼组织中检测的菝葜皂苷元浓度变趋势与血中相似,在150分钟达到高峰,然后逐渐下降。晶状体中可达3.29 ug/ml,而玻璃体中最大浓度是2.99 ug/ml。
为了验证知母抗氧化能力,我们进行了MTT,TUNEL,RT-PCR,Westernblot,单细胞电泳、细胞内钙离子检测等试验,结果如下:MTT试验显示,二酰胺对细胞存活率的影响是剂量依赖性的,随浓度增加,细胞生存率降低。100nm时作用明显(p<0.01)而芒果苷可以保护二酰胺对人晶状体上皮及视网膜色素上皮细胞的氧化作用,以致细胞凋亡。进一步的机制研究显示芒果苷可以防止二酰胺引起的细胞内GSH的降低。TUNEL实验显示,二酰胺可以引起细胞的凋亡,凋亡指数:对照组2.60±0.97,Mangiferin组2.78±0.67 Diamide 19·60±2·36。Diamide+Mangiferin组4.97±1.52。Westernblot实验结果也证实,二酰胺可以引发caspase3 的升高,而这个作用可以被芒果苷阻断。应用实时PCR检测(TAQMAN)基因表达检测,绘制标准曲线和设定内参照以18S rRNA为内对照,18S rRNA基因的CT值在14-18之间的认为是有效标本,确保RNA反转录效率的一致性.。
结果显示,基因表达上调的有:ACTA、HEPH、EIF2A、ERN、CRYAB、GSTZ。HEPH升高最显著。下调的有MARPK、FN等。(P<0.01)。而且经激光共聚焦显微镜检查,芒果苷可以抑制由NMDA受体引起的细胞内的钙离子变化。单细胞电泳的检测拖尾率%对照组 5.1二酰胺组86.4芒果苷+二酰胺组25.6。尾长(um)对照组18.38 二酰胺组36.17芒果苷+二酰胺组21.37.据此,我们可以得出结论,知母主要作用成分可以通过血眼屏障;知母对眼组织细胞又抗氧化作用。